Sau lây nhiễm ñược 7 ngày, bắt ñầu tiến hành ñánh giá khả năng kháng bệnh ñao ôn của các mẫu giống theo thang ñiểm của Kato:
Cấp 0: Không có vết – Kháng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh chỉ nhỏ bằng ñầu kim – Kháng (R)
Cấp 2: Vết bệnh to hơn, màu nâu nhạt ñến nâu tối – Kháng vừa (M) Cấp 3: Vết bệnh to hơn và có màu xám ở giữa – nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh có hình thoi ñặc trưng – Nhiễm nặng (HS)
2.5.5 Ứng dụng chỉ thị DNA xác ñịnh khả năng chứa các gen
2.5.5.1 Tách chiết DNA hệ gen
Hóa chất dùng ñể chiết tách DNA hệ gen:
Thành phần dung dịch ñệm chiết tách DNA (Phan Hữu Tôn, 2005).
Thành phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch làm việc Lượng cần cho 10ml đ tách chiết
Tris – HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5 ml
EDTA (pH= 8) 0,5M 0,25mM 0,5ml
NaCl 5M 300mM 0,6ml
SDS 10% 1% 1,0ml
H2O 7,4ml
`Thành phần dung dịch ñệm TE (Phan Hữu Tôn, 2005).
Thành phần Nồng ñộ dung dịch mẹ Nồng ñộ dung dịch làm việc dung dịch TE làm việc Lượng cần cho 50ml
Tris –HCl (pH=8) 1M 10mM 0,5ml
EDTA (pH =8) 0,5M 1mM 0,1ml
H2O 49,4ml
+ Hóa chất dùng cho chạy ñiện di trên gel agarose: Agarose 1%, ethidium bromide 10mg/ml, Loading Buffer (Bromophenol blue, Xylene cyanol, Succarose) TAE (Tris Base, glacial acetic acid, EDTA) 1X, DNA (DNA chuẩn ñã biết trước nồng ñộ).
Tách chiết DNA
Quy trình chiết tách DNA theo Zheng và cộng sự (2000) ñã ñược cải tiến như sau:
+ 2cm mẫu lá non thu vào buổi sáng ñược cắt nhỏ vào cối nghiền với 400µl dung dịch chiết cho tới khi thành dịch màu xanh lá câỵ Bổ sung 400µl dung dịch chiết vào cối rồi chuyển sang ống eppondorf.
+ Thêm 400µl dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C, hút dịch ñồng nhất phía trên.
+ Cho thêm vào ñó 400µl Chloroform : Isoamyalcohol (24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Thu dịch trên và tủa DNA bằng 800µl ethanol 99,9%, ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Phần DNA kết tủa dưới ñáy ống ñược giữ lại, rửa tủa bằng ethanol 70% và ñể khô tự nhiên bằng cách úp ngược ống nghiệm trên giấy thấm. Hòa tủa trong 50µl ñệm TẸ
+ Bảo quản ở 40C và sử dụng 1µl cho phân tích PCR.
2.5.5.2 Kiểm tra gen mùi thơm bằng PCR
+ PCR sử dụng cặp mồi theo nghiên cứu của Bradbury và cộng sự có trình tự sau:
ESP: 5’ - TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG -3’
IFAP: 5’- CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC -3’
+ 25 µl dung dịch phản ứng gồm có: 14.1µl nước cất, 0.2µl Taq DNA Polymerase, 2.5µl 10X buffer, 2µl 50 mM MgCl2, 0.2µl dNTPs 25 mM, 2.5µl mỗi primer, 1µl DNA nguyên bản.
+ PCR ñược thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: 940C trong 2 phút, 34 chu kỳ: 940C trong 30 giây, 720C trong 30 giây và 720C trong 5 phút.
+ Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose 1%. Bản gel ñược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV. Nếu bảng ñiện di xuất hiện vệt băng sáng có kích thước 257bp chứng tỏ mẫu có chứa gen thơm, ngược lại là mẫu không có chứa gen thơm.
2.5.5.3 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
- Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR ñược trình bày ở bảng dưới ñây:
Các mồi sử dụng ñể phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7
KH mồi NST Trình tự mồi Gen LK Khoảng cách cM Tài liệu tham khảo MP2 11 F: 5’-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA- CGA-GG-3’ R: 5’-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA- TTC-GGG-3’ Xa4 1.7cM N. Furuya et al, 1992 RG556 5 F:5’-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC- TGT-GC-3’ R:5’-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC- ATC-TC-3’ xa5 0-1cM Yoshimura et al., 1995 P3 6 F:5’-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA- GTA-GTG-GTT-3’ R:5’-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC- CAT-CAT-GGA-3’ Xa7 2.5 cM N. Furuya et al, 2003 - Thành phần dung dịch phản ứng PCR gồm có:
+ ðối với Xa4 và Xa7 thành phần 25µl gồm: 12.5 µl gotaq master mix; 1µl primer forward; 1µl primer revese; 1µl DNA mẫu và 9.5µl nuclease – free water.
+ ðối với xa5 thành phần 20 µl gồm có: 13.24µl nuclease – free water; 2.5µl buffer; 0.16µl dNTP 25mM; 1µl primer forward, 1µl primer revese, 0.1µl dream taq polymerase; 1µl DNA mẫụ