1.4.5.1 Nghiên cứu về chủng nòi và sự phát triển của bệnh bạc lá
Từ những kết quả của các nghiên cứu gần ñây về vi khuẩn bạc lá
Xanthomonas Oryzae P.v Oryzae. Cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng. Sự có mặt của các chủng bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của mỗi vùng: ở Philippin ñã phát hiện có 6 race ñang tồn tại, Nhật Bản có 12 phathotype, và ở Ấn ðộ có 9 typẹ.. (TikaB. Adhikavr Iw Mew và CTV, 1999; Tika B.Adhikari TW và cộng sự, 1999)
Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở Miền Bắc, ñến năm 2006 theo kết quả nghiên cứu của TS
Phan Hữu Tôn trên các mẫu bệnh thu thập ở các tỉnh Miền Bắc ñã phân lập ñược 154 Isolate và xác ñịnh ñược 10 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhaụ Trong ñó có 2 chủng, chủng 2 và 3 là phổ biến ở vùng ðồng Bằng Sông Hồng, song những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm cho dù xuất hiện với tần suất thấp hơn tuy nhiên chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho các giống lúạ (Phan Hữu Tôn, 2006).
Và gần ñây nhất, trong chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR ñã xác ñịnh ñược 16 chủng vi khuẩn Xanthonas Oryzae P.v oryzae gây bệnh khác nhau (Tạp chí KHKT,2009).
ðiều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở Miền Bắc nước ta ñang tăng lên nhanh chóng và ña dạng hơn, vì vậy mà ñòi hỏi phải tạo ra những giống lúa mang nhiều gen kháng bệnh có tính kháng ngang bền vững hơn.
1.4.5.2 Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá
Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá, các nhà khoa học Nhật Bản là những người ñi ñầu trong lĩnh vực nàỵ Nisimură1961) ñã có những nghiên cứu ñầu tiên về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá. Trong khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông ñã phát hiện khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng Kogyoku và kaganeman, ñược ñiều khiển bởi một gen trội nằm trên NST số 11 (Theo hệ thống thứ tự NST của ông).
Tiếp theo ñó IRRI cũng ñã tiến hành ñánh giá khả năng kháng bệnh của các giống lúa nhiệt ñới, ñồng thời tiến hành nghiên cứu về bản chất di truyền của khả năng kháng bệnh bạc lá là do gen quy ñịnh (dẫn theo Tsugufumi Ogawa, 1997)
Ngày nay, người ta ñã xác ñịnh ñược 29 gen kháng bạc lá lúa ký hiệu từ Xa1 ñến Xa29 (Kinoshita, Lin và ñv, zhang và ctv.2005). Gồm có 22 gen trội và 7 gen lặn là: xa5, xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24 (dẫn theo N.furuya, S.taura và cộng sự).
Các gen kháng thu thập từ nhiều nguồn khác nhau: gen kháng nguyên thuỷ có sẵn trong các giống lúa trồng, gen kháng ñược tạo bởi ñột biến như xa19, xa20, Xa25, hoặc các gen kháng có nguồn gốc từ các giống lúa dại như Xa21,Xa23 từ
Tính kháng bệnh bạc lá có thể ñược kiểm tra bởi một gen trội, một gen lặn hoặc gen trội không hoàn toàn, hay do nhiều gen cùng liên kết quy ñịnh. Tuy nhiên các gen kháng bạc lá dù là gen trội (Xa) hay gen lặn (xa) ñều có ý nghĩa ñối với chọn giống. Những gen lặn chỉ ñược dùng trong chương trình chọn giống lúa thuần do chúng chỉ biểu hiện ñược khả năng kháng khi ở dạng ñồng hợp, còn những gen trội lại có ý nghĩa ñối với cả việc chọn giống lúa lai và giống lúa thuần.
Tính kháng bệnh bạc lá cũng tuân theo học thuyết “gen ñối gen” nghĩa là alen kháng của ký chủ chỉ hoạt ñộng khi ký sinh mang alen không gây bệnh (PGS.TS.Nguyễn Văn Hiển và cộng sự, 2002). ðiều này ñã giải thích vì sao những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này lại bị nhiễm nặng ở vùng khác. Dựa vào thuyết này, người ta ñã thiết kế một bộ giống thử gồm các dòng ñẳng gen mang ñơn gen kháng và ña gen kháng nhằm xác ñịnh các chủng nòi vi khuẩn có ở một vùng. Mặt khác dựa trên các nòi vi khuẩn ñã ñược xác ñịnh, người ta có thể thống kê các gen kháng của một giống hoặc xác ñịnh một gen kháng mới chưa ñược biết tới (Trần Minh Thu, 2006).
Theo các kết quả nghiên cứu của K.S Lee thì kể từ khi các giống mang gen kháng Xa-4 ñầu tiên ñược sử dụng tại Philippin cho ñến nay ñã phát hiện khá nhiều chủng vi khuẩn có biểu hiện kháng với gen Xa-4 (K.s. Lee,2003). Như vậy sự ra ñời của các giống lúa kháng bệnh kéo theo sự tiến hoá của các chủng vi khuẩn, làm giảm tính bền vững của gen kháng bệnh. Mục tiêu nhằm kéo dài thời gian kháng bền vững của gen kháng là vô cùng quan trọng trong công tác chọn giống kháng bệnh bạc lá.
Theo Tika và Mew nghiên cứu về khả năng kháng bệnh trên 11 dòng ñẳng gen mang 1,2,3 hoặc 4 gen kháng bằng cách lây nhiễm nhân tạo với 50 chủng vi khuẩn thu thập tại Nepal. Kết quả cho thấy dòng nào mang nhiều gen kháng sẽ có biểu hiện nhiễm nhẹ hơn hẳn so với dòng chỉ mang 1 gen kháng (Tika B. Adhikari, Ram chandra Basnyat, T.w. Mew,1999; Tika B.Adhikari TW và cộng sự, 1999) . ðiều này cho thấy việc tổ hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giống chính là chiến lược ñể tăng phổ kháng cho giống và tăng ñộ bền của gen kháng.
1.4.5.3 Các phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh
Dựa trên cơ sở của tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy ñịnh, cho ñến nay phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất là phương pháp lai hữu tính, thông qua phương pháp này ta có thể chuyển những gen có khả năng kháng bệnh cao vào các giống có ñặc tính nông sinh học quý thông qua Backcross.Từ ñó mà nhiều giống kháng bệnh ñã ñược tạo rạ Khả năng kháng bạc lá thường do ñơn gen quy ñịnh, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại ñể chuyển gen kháng là rất hiệu quả. Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết ñể lai lại với một giống mang gen kháng hữu hiệụ Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới ñược tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm ñược gen kháng mong muốn. Trong qúa trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly ñể ñẩy nhanh quá trình.
Phương pháp lai hữu tính ñược tiến hành ñầu tiên ở Nhật Bản từ cây lúa chống bệnh ñầu tiên ñược phát hiện vào năm 1926 (Jennings và cộng sự,1979). ðến nay trên Thế giới ñã có rất nhiều nước áp dụng rộng rãi phương pháp này trên cả lúa thuần và lúa laị ðặc biệt Trung Quốc là một trong những nước áp dụng rộng rãi nhất phương pháp này họ ñã chuyển ñược một số gen có khả năng chống bệnh cao vào một số giống quan trọng trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng. ðiển hình là gen Xa-21 có phổ kháng rộng ñối với các nòi vi khuẩn ñã ñược chuyển thành công vào “Munghu63” là một dòng phục hồi ñược sử dụng rộng rãi trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng (Nguyễn Thị Kim Dung, 2008).
Phương pháp lây nhiễm nhân tạo ñược sử dụng ñể xác ñịnh con lai có mang gen kháng hay không. Nhưng bằng phương pháp này ñôi khi khó phân biệt ñược các gen kháng khác nhau, nếu chúng cùng biểu hiện một số phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương ứng. ðể khắc phục nhược ñiểm này, hiện nay phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR dựa trên các trình tự ADN liên kết chặt chẽ với gen kháng từ ñó mà có thể xác ñịnh các gen kháng dễ dàng và hiệu quả hơn. Tại viện Lúa ðồng Bằng Sông Cửu Long, Bùi Chính Bửu cùng cộng sự ñã sử dụng PCR ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa ñịa phương mang gen kháng Xa-4, xa5, xa13 với
nhiệt ñộ chính xác cao (Bùi Chính Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003).
Ngoài ra, hiện nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi và lai TB. Bằng phương pháp cứu phôi Anudẹ Border và cộng sự (1992) ñã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (Theo k.s Lee và cộng sự). Bằng cánh lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae Sativa L với nguồn cho gen kháng là lúa dại Oryzae (Meyeriana) Cheng- qui Yan và cộng sự ñã tiến hành thành công việc tạo dòng tế bào mang gen kháng bạc lá. Kết quả thu ñược 29 dòng cây lai xoma, hình thái biểu hiện giống cả hai bên bố mẹ, trong ñó có 2 dòng biểu hiện tính kháng cao, 8 dòng biểu hiện tính kháng vừa (Cheng-qui Yan và cộng sự, 2004)
Bên cạnh ñó còn có phương pháp gây ñột biến Invitro cũng tạo ra tính kháng, làm thay ñổi một số tính trạng nông sinh học cho giống, phương pháp này bước ñầu ñã ñược thực hiện và thành công ở trên cây lúa, ngô và khoai tâỵ..
1.4.5.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá
Sự phát triển của công nghệ sinh học, ñặc biệt là công nghệ gen ñã mang ñến những bước tiếng ñáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. Oyzae có thể ñược xác ñịnh nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku (2000) ñề xuất sử dụng 2 ñoạn mồi XOR-F và XOR-R2 ñể nhân ñoạn ADN, ñoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005).
Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng ñược áp dụng tành công trong việc xác ñánh giá sự ña dạng hay xác ñịnh chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009).
Ngày nay, ñã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng ñược lập bản ñồ liên kết với các ñoạn ADN genome, ñặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây lương thực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cộng sự, 1995; Miklas và cộng sự, 1996; ẠC.Sanchez, 2000). Dựa trên bản ñồ này, chỉ thị phân tử xác ñịnh
gen kháng bạc lá ñã ñược xây dựng. Kỹ thuật này ngày càng ñược sử dụng phổ biến bởi tính khả thi, tính hiệu quả và tính kinh tế. Chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng thành công trong việc xác ñịnh gen kháng (Nelson và cộng sự, 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng ñể tạo thành giống chứa ña gen kháng (Huang và cộng sự, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995).
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong ñánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa ñịa phương thu thập ñược ở duyên hải Trung bộ và ñồng bằng sông Cửu Long. Kết quả ñã thu ñược 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra ñộ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer ñối với gen xa5 cho thấy ñộ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi Chí Bửu và Cộng sự cũng ñã sử dụng chỉ thị phân tử ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa ñịa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với ñộ chính xác cao (Nguyen Vinh Phuc , 2005).
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lá của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và cộng sự ñã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng. Nhóm nghiên cứu ñã sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn ñể tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc. ðồng thời, ñể phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng ñẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc. Cho ñến nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 ñã ñược xác ñịnh là các gen kháng hầu hết các chủng vi khuẩn. Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng ñược tiến
hành ñánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn ở Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004).
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa ñịa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu ñã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở ñiều tra 145 giống lúa ñịa phương ñã phát hiện ñược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục ñiều tra 120 giống ñịa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát hiện ñược thêm 8 giống lúa ñịa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên ñều nhằm mục ñích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004, 2007).
ðến nay, bước ñầu có thể khẳng ñịnh các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa ñịa phương ở Việt Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước tạ Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5. Hiện chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện ñược gen Xa21 trên các giống lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác ñịnh gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan.