3.5.1.1. ðộẩm của nguyên liệu ñược xác ñịnh bằng phương pháp chưng cất với Toluen theo TCVN 6120:2007[7]
Dụng cụ gồm bình cầu, ñược nối với ống sinh hàn qua bộ phận xác ñịnh lượng nước. Bộ phận này bao gồm bầu ngưng tụ, bộ phận chia vạch và ống dẫn hơi. Bộ phận chia vạch ñược chia ñộ ñến 0,1 ml. Sau quá trình cất nước sẽ ngưng tụ ởñây vì vậy ta có thể ñọc ñược dễ dàng lượng nước chứa trong vật liệu ñem thử. Nguồn nhiệt thích hợp là bếp ñiện có biến trở hoặc ñun cách dầu.
Cách tiến hành
- Cho vào bình cầu ñã ñược làm khô 200 ml toluen (hoặc xylen), 2ml nước. Lắp dụng cụ (ñã ñược sấy khô). Cất khoảng 2 giờ. Ðể nguội trong 30 phút. Ðọc thể tích nước cất ñược ởống hứng, chính xác ñến 0,05 ml.
- Thêm vào bình cầu một lượng mẫu ñã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2- 3 ml nước. Thêm vài mảnh ñá bọt (ñá sôi). Ðun nóng nhẹ, khi toluen ñã bắt ñầu sôi thì ñiều chỉnh nhiệt ñể cất với tốc ñộ 2 giọt trong 1 giây. Khi ñã cất ñược phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc ñộ cất lên 4 giọt trong 1 giây. Tiếp tục cất cho ñến khi mực nước cất ñược trong ống hứng không tăng lên nữa.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28 Dùng 5-10 ml toluen rửa ống sinh hàn. Cất thêm 5 phút nữa. Tách bộ phận cất ra khỏi nguồn nhiệt. Nếu còn có những giọt nước ñọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen ñể rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lớp toluen ñã ñược phân tách hoàn toàn, ñọc thể tích nước trong ống hứng. Ðộ ẩm (x %) của nguyên liệu ñược tính theo công thức sau:
V1: số ml nước cất ñược sau lần cất ñầu V2: số ml nước cất ñược sau lần cất thứ hai p: số g mẫu ñã cân ñem thử
3.5.1.2. Hàm lượng phytosterol ñược phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Các ñiều kiện cột sắc ký pha ñảo (C8 và C18), các hệ dung môi triển khai acetonitril (ACN): ñệm phosphate 0,025M với các tỷ lệ khác nhau (90:10, 93:7, 95:5), tại các pH ñệm khác nhau (5,3; 5,8; 6,5; 4,8) và thay ñổi tốc ñộ dòng khác nhau (1,0; 1,2; 1,5 ml/phút) trên máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000- PDA detector.
Dung dịch thử: dịch phytosterol thu ñược hòa trong 2ml MeOH.
Dung dịch chuẩn: hòa tan 20 mg phytosterol trong 100ml MeOH. Các dịch ñược lắc siêu âm 5 phút ñể hoà tan, sau ñó lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào máy. Quy trình phân tích HPLC ñược xây dựng, tối ưu hoá các thông số tỷ lệ pha ñộng, pH, tốc ñộ dòng và bước sóng phát hiện và thẩm ñịnh tính tương thích hệ thống, ñộ tuyến tính, ñộ chính xác, ñộñúng (tỷ lệ phục hồi) và giới hạn ñịnh lượng (LOQ).
3.5.1.3. Chỉ số acid ñược xác ñịnh theo TCVN 6127:2007[5]
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết ñể trung hòa các acid tự do có mặt trong 1 g dầu. Dầu trong quá trình thủy phân tự nhiên sinh ra các acid béo tự do và glycerol. Xác ñịnh chỉ số acid là một trong những phương pháp hữu hiệu ñể xác ñịnh ñộ hư hỏng của dầu bởi quá trình thủy phân.
Cách tiến hành: cân mẫu vào bình tam giác, thêm vào ñó 30–40 ml hỗn hợp dung môi n-hexan và benzen ñã ñược trung hòa, lắc cho tan mẫu. Tiếp ñó cho vào 3 – 5 giọt chỉ thị phenolphthalein và chuẩn ñộ bằng dung dịch KOH 0,1 N ñến khi xuất hiện màu hồng nhạt và bền màu trong 30 giây. Tính kết quả:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29 AV = m V N × × 1 , 56 Trong ñó:
AV: chỉ số acid (mg KOH/g dầu)
N: nồng ñộñương lượng gam của dung dịch KOH V: thể tích dung dịch KOH ñã dùng khi chuẩn mẫu (ml) m: khối lượng mẫu thử (g)
56,1: khối lượng phân tử của KOH
3.5.1.4. Hàm lượng vitamin E ñược xác ñịnh theo mô tả trong Dược ñiển Việt Nam[2]
Xử lý mẫu và chuẩn vitamin E theo quy trình AOAC 992.03: chuẩn/mẫu ñược xà phòng hóa và chiết lỏng- lỏng bằng n-hexane. Dung dịch sau chiết ñược làm khô bằng cô quay chân không và ñịnh mức lại bằng 5mL methanol, ñóng vial và xác ñịnh vitamin E bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao có ñầu dò UV bước sóng 280 nm, cột sắc ký pha ñảo: C18 250 x 4,6mm. ðiều kiện chạy máy: + Thể tích tiêm: 100µL. + Pha ñộng: methanol. + Tốc ñộ dòng: 2ml/phút. + Thời gian chạy: 15 phút. Tiến hành phân tích
+ Tiến hành tiêm chuẩn vào máy, ghi lại sắc ký ñồ của chuẩn.
+ Tiến hành tiêm mẫu cần phân tích vào máy, ghi lại sắc ký ñồ của mẫu.
Tính toán hàm lượng vitamin E trong mẫu bằng cách so sánh diện tích peak của chất phân tích trong mẫu với diện tích của dung dịch chuẩn.
3.5.1.5. Phân tích cảm quan, chỉ tiêu vi sinh, hàm lượng kim loại nặng
Mục ñích kiểm tra cảm quan ñối với sản phẩm vitamin E của ñề tài nhằm ñánh giá các ñặc tính vật lý của sản phẩm: trạng thái, màu sắc.
- Trạng thái: sản phẩm dạng lỏng - Mầu sắc: màu vàng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30 - Chỉ tiêu vi sinh theo TCVN 6096-2004
- Hàm lượng kim loại nặng TCVN 6193-1996