63
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 trên hàm lượng của sucrose trong đệm sucrose như sau: hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 sử dụng đệm sucrose 40% trong 6h (phương pháp b) là 27%, sử dụng đệm sucrose 45% trong 10h (phương pháp a) là 18,1% (Bảng 4.1). Tuy nhiên, độ tinh khiết của protein L1 sử dụng phương pháp (a) cao hơn so với phương pháp (b). Do đó, tăng hàm lượng sucrose làm tăng độ tinh khiết nhưng giảm hiệu suất thu hồi.
4.3.2.2. Tủa Ammonium sulfate:
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 vào hàm lượng ammonium sulfate sử dụng (40%, 45% và 50%) được phân tích bởi SDS-PAGE và Western blotting.
Hiệu suất thu hồi bằng cách sử dụng tủa ammonium sulfate là 78,3% trong khi sử dụng siêu ly tâm (a) và (b) tương ứng là 18,1% và 27% (Bảng 4.1). Những kết quả này chứng tỏ 45% ammonium sulfate là tối ưu cho thu hồi L1 từ dịch phân tế bào và tủa ammonium sulfate hiệu quả hơn siêu ly tâm sử dụng đệm sucrose.
4.3.2.3. Sắc ký kích thước – loại trừ (size – exclusion chromatography):
Sắc ký kích thước – loại trừ sử dụng cột kích thước Sephacryl S-1000. Các phân đoạn thu được kiểm tra tại bước sóng 280nm và phân tích bằng SDS-PAGE và Western blotting. Protein L1 (55,9 kDa) được phát hiện trong các phân đoạn 42-74. Độ tinh khiết của HPV 16 L1 trong các phân đoạn 42-54 cao hơn trong các phân đoạn 56- 70 (Hình 4.4).
4.3.2.4. Sắc ký trao đổi cation:
Các phân đoạn 42-54 hay tất cả phân đoạn thu được từ sắc ký kích thước-loại trừ được cho vào cột trao đổi cation Poly-Prep sử dụng đệm có chứa 0,1 M NaCl. Hiệu suất thu hồi của HPV 16 L1 được xác định bởi SDS-PAGE, ELISA và Western blotting. Độ tinh khiết cuối cùng trong mỗi trường hợp là 98,5-100%. Trong phương pháp (a), các phân đoạn 42-54 từ sắc ký kích thước-loại trừ được thu nhận và đem sắc
64
ký trao đổi cation. Độ tinh khiết của các mẫu trong phương pháp (a) là 19,2% (mức cao nhất của độ tinh khiết), cột được rửa bằng đệm có chứa 0,35 M NaCl. Các mẫu thu được bằng phương pháp (b) và (c) có chứa nhiều tạp hơn. Sử dụng một bộ đệm rửa mới có chứa 0,6 M NaCl để loại bỏ các tạp chất. Độ tinh khiết của HPV 16 L1 đã tăng từ 1% đến 98,5% theo phương pháp (c) (Bảng 4.1).
Hình 4.4: Tinh sạch HPV 16 L1 bằng sắc ký trao đổi cation.
Sắc ký trao đổi cation được thực hiện bằng phương pháp (a), (b) và (c) (Bảng 4.1). Kết quả tinh sạch bằng các phương pháp (a), (b) và (c) được hiển thị trên gel SDS-PAGE tương ứng (A), (B) và (C); làn 1: các phân đoạn thu nhận từ sắc ký kích thước - loại trừ; làn 2: không ràng buộc; làn 3: qua rửa; làn 4: eluted. Protein HPV 16 L1 tách bằng phương pháp (c) phát hiện bằng Western blotting (D).
65
Hình 4.5: Hình ảnh lắp ráp protein HPV 16 L1 dưới KHV điện tử.
4.3.2.5. Tự lắp ráp các protein tinh khiết HPV 16 L1 thành VLPs:
HPV 16 L1 tinh chế bằng phương pháp (c) tự lắp ráp thành VLPs khác nhau, đường kính từ 35 nm đến 64 nm với đường kính chính 49 nm (Hình 4.5).
Hiệu suất thu hồi bằng các phương pháp (a), (b) và (c) tương ứng là 1,9%, 10,2% và 30,6% (Bảng 4.1). Những kết quả này chứng tỏ rằng tủa ammonium sulfate thì hiệu quả cho thu hồi HPV 16 L1, và các tạp chất từ bước này có thể được loại bỏ bằng cách tối ưu sắc ký kích thước-loại trừ và sắc ký trao đổi cation. [27]
66
Như vậy điều kiện tối ưu để sản xuất và tinh sạch protein HPV 16 L1 là nuôi cấy chủng nấm men S. cerevisiae Y2805 chứa plasmid YEGa-HPV 16 L1 trong môi
trường YPDG với nguồn carbon 4% (1% glucose và 3% galactose), tủa protein L1 sau khi dịch phân bằng ammonium sunfate (phương pháp c), sau đó đem sắc ký kích thước – loại trừ và sắc ký trao đổi cation thu được protein HPV 16 L1 tinh khiết có khả năng tự lắp ráp thành VLPs, thành phần của vaccine ngừa HPV và ung thư cổ tử cung.
67
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN
Ung thư cổ tử cung là một trong những ung thư thường gặp, có tần suất cao thứ hai trong các ung thư phụ nữ trên thế giới (chỉ xếp sau ung thư vú). Phần lớn số ca ung thư cổ tử cung xảy ra ở các nước đang phát triển. Tại Việt Nam, ước tính cứ 100.000 phụ nữ thì có 20 trường hợp mắc bệnh và 11 trường hợp tử vong.
Theo các nghiên cứu về dịch tễ học, các yếu tố nguy cơ của ung thư cổ tử cung như: tuổi giao hợp lần đầu, nhiều bạn tình, sinh đẻ nhiều, hút thuốc, nhiễm
Trichomonas, nhiễm Herpes Simplex II, nhiễm Human papilloma virus (HPV)... thì
việc nhiễm HPV là yếu tố nguy cơ cao nhất. Có ít nhất 50% người có hoạt động tình dục bị nhiễm HPV trong cuộc đời. Do đó, các nhà khoa học chú ý nhiều đến loại nguyên nhân này và hiện nay đã có vaccin phòng ngừa nhiễm HPV.
Vaccine phòng ngừa HPV là loại vaccine tái tổ hợp sử dụng các thành phần gây miễn dịch của virus (virus like particle) có chứa các gen L1, L2 của HPV. Hiện tại, đã có 2 loại vaccine đã được công nhận đảm bảo tiêu chuẩn an toàn và hiệu lực bảo vệ. cho phép sử dụng rộng rãi là vaccine tứ giá Gardasil (Merck) chống HPV 6, 11, 16, 18 và vaccine nhị giá Cervarix (GSK) chống HPV 16, 18.
Sự ra đời và phát triển của vaccine phòng ngừa HPV đã giúp thế giới đối phó & đẩy lùi được căn bệnh ung thư cổ tử cung. Hiện nay Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công nhận tiêm vaccine là phương pháp bảo vệ hiệu quả nhất giúp nhân loại chống lại các bệnh truyền nhiễm. Ngành vaccine học (vaccinology) ra đời vào cuối thế kỷ XVIII bởi bác sĩ thú y Edward Jenner (Anh) với vaccine phòng bệnh đậu mùa. Sau đó, Louis Pasteur (Pháp) đã tạo ra một trường phái riêng của vaccine tồn tại cho đến ngày nay. Sang thế ký XX, mặc dù công nghệ vaccine có những bước tiến vượt bậc và đạt nhiều thành tựu đáng kể nhưng cũng phải đối mặt với nhiều thách thức, nhiều bệnh dịch nguy hiểm tái phát và mới xuất hiện chưa có vaccine phòng ngừa như: HIV/AIDS, bò điên, sốt xuất huyết, SARS, cúm gà…
Virus học và nuôi cấy mô phát triển là tiền đề cho phát triển vaccine. Đặc biệt khi miễn dịch học hiện đại và công nghệ gen tái tổ hợp ra đời đã kích thích mạnh mẽ
68
nghiên cứu sản xuất vaccine công nghệ cao. Hiện nay, nhiều nhà khoa học thuộc các lĩnh vực sinh, hóa, lý và công nghệ đã kết hợp với nhau nghiên cứu ưng dụng công nghệ gen và protein trong phát triển vaccine. Ngoài 3 loại vaccine cổ điển, các nhà khoa học đang phát triển 6 loại vaccine thế hệ mới: sử dụng phụ gia (adjuvant) mới, sử dụng vector tái tổ hợp, vaccine khảm, vaccine polypeptid, anti-idiotype, vaccine DNA. Các nhà khoa học cũng đã phối hợp nhiều loại vaccine vào một mũi tiêm (vaccine đa giá) để hạn chế số lần tiêm vaccine.
Các công nghệ mới trong sản xuất vaccine như tái tổ hợp DNA (rDNA), tinh sạch protein…đã tạo ra nhiều ứng dụng trong sản xuất các loại vaccine đặc hiệu cho nhiều loại bệnh mà y học bó tay (viêm gan siêu vi B, viêm não Nhật Bản, ung thư cổ tử cung…)
Ngoài các loại vaccine tiêm và uống hiện nay, vaccine trong tương lai còn có thể là các loại: DNA tái tổ hợp di truyền, vaccine ăn qua miệng, vaccine tinh thể Trehalose, vaccine dán trên da…
69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=151340.
2. http://www.ictvdb.org/ICTVdB/index.htm.
3. Ha Linh Vu, Andrew G. Sikora, Shibo Fu, Johnny Kao, HPV-induced oropharyngeal cancer, immune response and response to therapy.
4. Janel Dockter, Astrid Schroder, Barbara Eaton, Ann Wang, Nathan Sikhamsay, Liezel Morales, Cristina Giachetti, Analytical characterization of the APTIMA® HPV Assay.
5. Human papillomaviruses World Health Organization, International Agency for
Research on Cancer 2007.
6. http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2008.
7. Ung thư học nội khoa – PGS Nguyễn Chấn Hùng – NXB Y Học TP.HCM – Năm 2004.
8. Manual of Clinical Oncology – 6th – 1994 – UICC.
9. Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Shah KV 1994 The role of HPV in the etiology of cervical cancer.
10.www.womens-health.com/
11.www.path.org/cervicalcancer.
12.Canavan TP, Doshi NR (2000). "Cervical cancer". Am Fam Physician 61 (5):
70
13.Nanda, Rita (2006-06-09). "Cervical cancer". MedlinePlus Medical Encyclopedia. National Institutes of Health.
14.http://afamily.vn/suc-khoe/20100122121132261/Dau-hieu-ban-dinh-ung-thu-co-tu-
cung/
15.Bệnh lý ung thư cổ tử cung - BS Nguyễn văn Bích, BS Nguyễn Văn Trọng, 04/ 02/ 2010.
16.DiSaia PJ, Creasman WT. Clinical gynecologic oncology. 5th ed. St. Louis: Mosby, 1997.
17.http://screening.iarc.fr/colpochap.php?lang=1&chap=2
18.HPV và Ung thư cổ tử cung - ThS. BS. Đặng Lê Dung Hạnh, Bệnh viện Hùng Vương.
19.Kitchener HC, Castle PE, Cox JT. Achievements and limitations of cervical cytology screening. Vaccine. 2006;24(Suppl 3):63–70.
20.Sarian LO, Derchain SF, Naud P, et al. Evaluation of visual inspection with acetic acid (VIA), Lugol’s iodine (VILI), cervical cytology and HPV testing as cervical cancer screening tools in Latin America. Tis report refers to partial results from the LAM Study. Journal of Medical Screening. 2005;12(3):142– 149.
21.Bước đầu chẩn đoán HPV bằng phương pháp sinh học phân tử tại BV phong – da liễu trung ương Quy Hòa – BS Nguyễn Phúc Như Hà.
22.Điều trị Ung thư cổ tử cung - Dr Nguyễn Văn Bích, ĐH Y Dược TPHCM, ngày 16/03/2010.
23.HPV Vaccines and Screening in the Prevention of Cervical Cancer. Vaccine, Vol 24, Sup3, Aug 2006. ELSEVIER.
71
24.http://www.uq.edu.au/uqresearchers/researcher/frazerih.html
25.www.merck.com & http://www.gardasil.com/
26.http://www.gsk.com.au/products_vaccines_detail.aspx?view=122 &
http://www.cervarix.com/
27.Optimum conditions for production and purification of humanpapillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae, Min-A Park, Hyoung Jin Kim, Hong-Jin Kim, College of Pharmacy, Chung-Ang University, South Korea.