Realtime PCR. Xét nghiệm này được thực hiện tại phòng xét nghiệm khoa Vi sinh bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và bệnh viện Trung Ương Huế.
- Kỹ thuật: kỹ thuật khuếch đại chuỗi polymerase (PCR).
- Nguyên tắc: về mặt nguyên tắc, phản ứng khuếch đại chuỗi DNA (PCR) bao gồm 3 giai đoạn được thực hiện ở ba nhiệt độ khác nhau và diễn ra tuần tự như sau:
+ Tăng nhiệt độ (94 °C), nhằm tách các chuỗi DNA ra.
+ Hạ nhiệt độ xuống để gắn kết các chuỗi mồi amorce, khoảng từ 40- 70 °C, cho phép các chuỗi mồi đặc hiệu lai trên đoạn DNA cơ bản.
+ Giai đoạn tổng hợp DNA (còn gọi là kéo dài chuỗi mồi) do tác dụng của enzyme Taq polymerase thực hiện ở 72 °C, gần với nhiệt độ tối ưu.
- Mỗi giai đoạn kéo dài khoảng 30-60 giây, cả 3 giai đoạn này (tháo xoắn, lai, kéo dài) tạo nên một chu kỳ. Thông thường, có khoảng 30 lần nhân lên tuần tự nhau được thực hiện.
- Số lượng các bản sao của chuỗi khuếch đại sẽ gấp đôi sau mỗi lần nhân lên. Sau n chu kỳ, số bản sao lý thuyết sẽ là 2n. Như vậy sau 30 chu kỳ số bản sao sẽ là 230.
+ Dùng HBV Realtime PCR Mỹ của công ty Việt Á, mỗi hạt bao gồm đệm, bốn loại deoxy-ribonucleotides (ATP, GPT, CTP, TTP).
+ Q PCR Standard kit (3 nồng độ: 102, 104, 106 copies/ml) của Việt Á. + Tách chiết DNA theo phương pháp Boom.
+ Máy PCR: chạy trên máy PCR định lượng của hãng Stratagene MX 3000 (Mỹ).
+ Chụp ảnh trên máy chụp ảnh Gel Transluminator UVP TM- 20 (Upland, USA).
- Quy trình xét nghiệm HBV DNA + Thu thập mẫu và xử lý
* Lấy máu tĩnh mạch, lấy buổi sáng vào lúc đói.
* Máu chỉ giữ ở 4-80c trong tối đa 4 giờ sau đó tách chiết huyết thanh. * Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng.
* Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút.
* Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào một tube vô trùng. * Giữ tube huyết thanh ở -200c cho đến khi tiến hành xét nghiệm. + Tách chiết DNA.
* Bộ kit tách chiết DNA bằng phenol/chloroform (VA.A92-001-50 Test/bộ).
* Thành phần bộ kit
Hóa chất dùng cho tách chiết DNA Dung dịch 1: 50ml
Dung dịch 2: 20ml Dung dịch 3: 30ml Dung dịch 4: 50ml Dung dịch 5: 10ml
* Dụng cụ dùng cho tách chiết DNA Tube 1,5ml vô trùng : 100 cái.
Vật liệu thiết bị cần thiết.
Máy ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút dùng cho tube 1,5ml; máy vortex- máy ủ nhiệt khô.
Máy Realtime PCR và hệ thống máy tính. Tủ thao tác vô trùng, micropipettes.
Vật liệu tiêu hao: găng tay cao su, đầu tube có bộ phận lọc. * Phương pháp tiến hành
Đánh dấu tất cả các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
Cho 200µl mẫu vào một tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch 1, votex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào một tube vô trùng có sẵn 600µl dung dịch 3. Trộn đều để yên 10 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn màu xanh. Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn. Để khô ở nhiệt độ 600c trong 10-15 phút. Cho vào 50ml dung dịch 5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Thực hiện phản ứng Realtime PCR
Thực hiện phản ứng này với các tube PCR mix được giữ ở trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR cần.
Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
Nếu máy Realtime PCR đọc tù đáy của tube: viết ký hiệu mẫu trên nắp hoặc trên thân phần thân sát nắp.
Chọn 5 chứng +, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào trong từng tube HBV q PCR Mix. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong đặt các tube vào máy Realtime PCR cùng với một bộ chuẩn.
Bật máy Realtime PCR, nhất là đèn của đầu lọc Realtime ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và thực hiện các chế độ làm việc như đã cài đặt.
* Phân tích kết quả
Sau khi kết thúc chương trình Realtime PCR chuyển sang chế độ “analysis” để phân tích kết quả. Có thể phân tích dưới dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai. Các kết quả dương tính sẽ được nhân với 50 sẽ thu được kết quả tải lượng virus/ml (copies/ml). Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3 x 102 copies/ml, do đó kết quả sau khi nhân với 50 nếu ≥ 3 x 102 thì kết luận “mẫu dương tính: a copies/ml”, nếu < 3 x 102 copies/ml thì kết luận “mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện” [55].
2.2.3.5. AST, ALT
- Được thực hiện tại phòng xét nghiệm khoa Sinh hóa bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế và bệnh viện Trung Ương Huế.
- Định lượng transamine bằng phương pháp động học theo phương pháp khuyến cáo của Hội hóa lâm sàng quốc tế 2006 [6].
- Đo hoạt độ của AST trong huyết thanh
+ Nguyên lý: cho huyết thanh bệnh nhân tác dụng với cơ chất, định lượng Oxaloacetat tạo thành.
L-aspartate + α-Cetoglutarat → oxaloacetate + L-glutamate Oxaloacetate + NADHH → L – maleate + NAD
+ Thuốc thử * Đệm pH 7,8 88mmol/l * L-Aspartate 260mmol/l * MDH ≥ 600 U/L * LDH ≥ 900 U/L * NADH 0,20mmol/l * Cetoglutarat 12 mmol/l + Thực hiện * Thuốc thử 500µl Huyết thanh 50 µl
Trộn đều hóa chất với huyết thanh bệnh nhân ủ trong một phút tại nhiệt độ phản ứng, đọc độ hấp thụ ban đầu, đọc lại chính xác sau 1,2,3 phút. Ghi kết quả trên máy đơn vị U/l.
- Đo hoạt độ của ALT trong huyết thanh
+ Nguyên lý: cho huyết thanh bệnh nhân tác dụng với cơ chất, định lượng Pyruvat tạo thành.
L-Alanine + Cetoglutarat → Pyruvat + L-Glutamate
Pyruvat + NADHH → L-Malate + NAD
+ Thuốc thử: * Đệm pH 7,5 111mmol/l * L-Alanine 550mmol/l * LDH ≥ 1200 U/L * NADH 0,02mmol/l * Cetoglutarat 16mmol/l
- Giá trị bình thường của AST và ALT * AST nam: 0-37 U/L; nữ: 0-31 U/l * ALT nam: 0-40 U/L; nữ: 0-32 U/L
2.2.3.6. Bilirubin