Lựa chọn cơ chế tách

Tiến hành chạy điện di hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên 3 loại

dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM; Na2B4O7 10mM + SDS 50mM ; Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM.

Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C

Các điện di đồ thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC

Nhận thấy nếu chỉ dùng phƣơng pháp điện di mao quản vùng (CZE) thì không tách đƣợc 3 chất ra khỏi nhau. Vì pKa của Lamivudin (pKa= 3,31 ) và Nevirapin (pKa= 2,42) khá gần nhau. Trong dung dịch điện ly nền với khoảng pH nhất định thì 2 chất

Na2B4O7 10mM

Na2B4O7 10mM + SDS 50mM

Na2B4O7 10mM + β-CD 10mM.

này bị ion hóa giống nhau, 2 chất đi ra khỏi mao quản trong cùng một thời điểm nên trên điện di đồ chỉ xuất hiện 2 pic mà thôi.

Thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm (SDS) thì độ phân giải giữa 3 chất tăng rõ rệt. Cả 3 chất đƣợc tách rõ ràng trên điện di đồ. Vì mỗi chất sẽ có sự phân bố vào Pha tĩnh giả SDS khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau. Nhƣ vậy các hoạt chất này sẽ tách đƣợc theo cơ chế MEKC.

Còn khi thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất chọn lọc đối quang β- CD thì trên điện di đồ cũng chỉ xuất hiện 2 pic có nghĩa là yếu tố không gian của 3 chất này không ảnh hƣởng tới quá trình tách. Chất hoạt động bề mặt β- CD không đƣợc lựa chọn.

Chọn phƣơng pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt là SDS đối với các khảo sát còn lại cho các hoạt chất này.

3.1.6. Ảnh hƣởng pH của dung dịch điện li nền

Ảnh hƣởng pH trong dung dịch đệm điện di đƣợc khảo sát với dung dịch điện di chứa:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM + SDS 50mM

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C

Gía trị pH thay đổi tại pH = 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17.

Hình 3.3. Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17

Vì mao quản đƣợc sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 8,76 đến 10,17 (>4), bề mặt

pH= 9,06

pH= 9,30

pH= 9,62

mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thƣờng hƣớng theo phƣơng từ anốt (cực dƣơng) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dƣơng) nghĩa là ngƣợc chiều với hƣớng của dòng EOF. Do từng tính chất riêng của các chất phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau. Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi không bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di thẩm thấu. Kết quả là trong dòng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và các ion mang điện tích âm. Mixen và dòng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau.

Khi điện di ở pH từ 8,76 đến 10,17 làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan bị thay đổi theo. Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi chất tan bị dƣơng điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngƣợc lại. Kết quả sẽ làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao hơn giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di chuyển về phía anốt (đầu cực dƣơng) chậm hơn dòng EOF. Nhƣ vậy cùng với tác dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm thay đổi cả tốc độ của dòng EOF.

Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đổi lớp điện kép và thế Zêta. Qua đó mà tác động hay làm ảnh hƣởng đến sự điện di của chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Từ hình 3.3, ở pH =8,76 đến 9,06 các chất vẫn tách nhau tốt, nhƣng thời gian phân tích dài hơn, đƣờng nền dốc.

Nhận thấy càng tăng pH từ 9,62 đến 10,17 thì khả năng tách tốt hơn, và pic nhọn hơn, ảnh hƣởng của nền có hấp thụ UV và các chất phân tích hấp thụ UV giảm

dẫn đến diện tích pic giảm. Ở pH= 9,30 các chất tách nhau tốt, độ hấp thụ tốt, giảm hấp thụ đƣờng nền và thời gian phân tích hợp lý.Vì thế chúng tôi chọn pH= 9,30 cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.7. Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế ngƣời ta chọn chất đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao quản. Qua đó sẽ làm ảnh hƣởng đến độ điện di hiệu dụng µefcủa chất phân tích.

Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thƣờng có hiệu lực tốt hơn các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ cao mà không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản.

Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: Na2HPO4 10mM, Natricitrat 10mM , Natritetraborat 10mM

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml.

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C

Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong dung dịch điện li nền Na2HPO4 10mM và Natricitrat 10mM thì chƣa xuất hiện pic trƣớc thời gian 15 phút, mặt khác cƣờng độ dòng điện không ổn định. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn dung dịch điện li nền Natritetraborat cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất tạo mixen SDS

Chất hoạt động bề mặt SDS đƣợc xem nhƣ pha tĩnh giả của quá trình tách vì thực chất nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di có ảnh hƣởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các chất bởi nó liên quan đến sự hình thành hạt Mixen cũng nhƣ nồng độ Mixen trong dung dịch đệm

điện di. Để khảo sát ảnh hƣởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 25 mM; 50 mM và 75 mM. Các điều kiện khảo sát:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM, pH = 9,30.

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C

Hình 3.4. Điện di đồ tại nồng độ SDS = 25 mM;50 mM và 75 mM

Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên thành mao quản qua tƣơng tác ionic hay hiệu ứng kị nƣớc. Các chất hoạt động bề

SDS 25mM

SDS 50mM

mặt đƣợc dùng trong MEKC cũng có thể tƣơng tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hƣởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tƣơng tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hƣớng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Chất hoạt động bề mặt là SDS là dạng anionic làm tăng dòng EOF, sẽ di chuyển về anot ( cực dƣơng) nghĩa là ngƣợc chiều với hƣớng của dòng EOF.

Theo công thức (11), độ phân giải R có thể đƣợc tăng cao khi tối ƣu hóa đƣợc số đĩa N lớn nhất, khi chọn đƣợc điều kiện để có độ chọn lọc α và hệ số dung tích k‟i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k‟i nói chung là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng tăng nồng độ thì thời gian lƣu các chất càng tăng do ảnh hƣởng của nồng độ các ion trong dung dịch càng lớn, tƣơng tác với Mixen bền và lâu hơn sự di chuyển của nó, dẫn đến tốc độ di chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lƣu tăng, cƣờng độ dòng cũng tăng, chiều cao pic bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo dãn và tù hơn.

Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại ionic với nồng độ cao thƣờng gây ra sự tăng cƣờng độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nóng lên. Tại nồng độ 75 mM nhận thấy thời gian phân tích dài hơn so với nồng độ 50 mM và 25 mM,chiều cao pic giảm. Nồng độ SDS 25 mM hiệu quả tách cũng tốt nhƣng chiều cao pic không bằng 50 mM, sẽ gây ảnh hƣởng độ nhạy. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ SDS = 50 mM tối ƣu để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, ngƣời ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của điện di. Nhƣ vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải

Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền Na2B4O7 tại bốn gía trị là 5 mM; 10 mM; 20 mM; 30 mM với điều kiện khảo sát nhƣ sau:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 + SDS 50mM, pH = 9,30. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C Hình 3.5. Sắc đồ điện di tại nồng độ đệm 5 mM, 10 mM, 20 mM 5mM 10mM 20mM

Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của các hoạt chất càng tăng, thời gian lƣu của chất tan tăng.

Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thƣờng làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tƣợng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thƣờng làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 30 mM.

Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hƣởng đến dòng EOF và quá trình điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hƣởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ dung dịch điện li nền 30 mM nồng độ đệm cao nên cƣờng độ dòng không ổn định và sụt tín hiệu.

Nồng độ đệm 5 mM, lực ion thấp hơn, giảm đƣợc cƣờng độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn nhƣng chiều cao, diện tích pic giảm hơn. Còn nồng độ đệm là 20mM thì độ phân giải cũng tăng nhƣng thời gian phân tích dài hơn. Do đó chúng tôi chọn nồng độ 10 mM đệm Borat là điều kiện tối ƣu.

3.1.10. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 3s, 5s và 7s với điều kiện khảo sát nhƣ sau:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM + SDS 50mM, pH = 9,30.

Hình 3.6.Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s

Khi nạp mẫu vào mao quản, lƣợng mẫu hay vùng mẫu nạp phải nhỏ hơn giới hạn cho phép (2% ≤ chiều dài l). Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng của vùng mẫu sẽ xuất hiện mạnh, do hiện tƣợng khuếch tán. Vùng mẫu càng lớn thì sự phân tán càng lớn. Lúc này độ phân giải và hiệu suất tách (Nef ) sẽ bị khử (bị giảm mạnh) theo sự phân tán mở rộng của vũng mẫu của chất phân tích trong mao quản.

Ta có công thức [8]: ()2 = (Winj)2/12 Với σ : Độ biến động hay độ lệch chuẩn của sự tách trong CE

Bơm mẫu 3s

Bơm mẫu 5s

Winj : Độ rộng củamẫu đƣợc nạp vào đầu ống mao quản

Từ công thức trên cho thấy, khi vùng mẫu Winj lớn, thì độ lệch chuẩn σ cũng lớn theo. Nghĩa là số đĩa lý thuyết của cột tách sẽ giảm.

Hình 3.6 thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên nhƣng không đáng kể. Trong cùng một điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lƣu các chất hầu nhƣ không thay đổi hoặc thay đổi rất ít, chỉ có chiều cao các pic thay đổi. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian bơm mẫu 5s là điều kiện tối ƣu.

3.1.11. Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di

Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 22 kV với điều kiện khảo sát nhƣ sau:

- Bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C

15kV V

Hình 3.7. Điện di đồ ở thế điện di 15kV, 20kV và 22kV

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trƣờng E và dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V đƣợc dùng sao cho không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng này chỉ nên nằm trong khoảng vùng từ 10-75 μA.

Khi tăng thế điện từ 15kV đến 22kV, thời gian di chuyển của các chất càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, nhƣng thời gian di chuyển của cấc chất ở 15kV khá lớn gần 14 phút mới xuất hiện pic của chất thứ 3.

Với thế 22kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Mục lục