3.2.7.1. Kết quả định lượng trong viên nén AVOCOMB-N:
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân 20 viên Avocomb-N, xác định đƣợc khối lƣợng là 24,6804g. Do đó khối lƣợng trung bình của 1 viên là 1,2340g.
Nghiền 20 viên thành bột mịn và trộn đều. Pha 3 mẫu thử nhƣ sau: Cân T1= 0,1230 g; T2= 0,1238 g; T3 = 0,1261g , hòa tan hoàn toàn bằng 10ml Metanol, thêm 70 ml nƣớc deion siêu âm cho tan hết, thêm nƣớc deion đến vừa đủ thể tích 100ml, lắc đều. Lọc qua giấy lọc đƣờng kính lỗ lọc 11cm. Bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc đƣợc tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc 0,45µm. Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu. Các mẫu đƣợc lọc qua màng lọc 0,2 µm trƣớc khi cho vào lọ phân tích.
Tiến hành chạy điện di theo điều kiện đã chọn ở mục 3.1.13. Căn cứ vào diện tích pic thu đƣợc trên điện di đồ ta tính ra nồng độ các hoạt chất trong chế phẩm nhƣ trong bảng 3.13.
Bảng 3.13.Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N
Mẫu thử
Hàm lƣợng hoạt chất trong 1 viên (mg)
% Hàm lƣợng so với trên nhãn
Lamivudin Nevirapin Zidovudin Lamivudin Nevirapin Zidovudin
T1 152,6 203,5 298,3 100,4 101,8 99,43
T2 148,3 205,0 295,5 98,87 102,5 98,5
62
Hình 3.20 .Điện di đồ định lượng viên nén Avocomb-N
3.2.7.2.Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân 20 viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg, xác định đƣợc khối lƣợng là 15,5181g. Do đó khối lƣợng trung bình của 1 viên là 0,7759g.
Nghiền 20 viên thành bột mịn và trộn đều. Pha 3 mẫu thử nhƣ sau: Cân T1= 0,0777 g; T2= 0,0781 g; T3 = 0,0768 g , hòa tan hoàn toàn bằng 10ml Metanol, thêm 70 ml nƣớc deion siêu âm cho tan hết, thêm nƣớc deion đến vừa đủ thể tích 100ml , lắc đều. Lọc qua giấy lọc đƣờng kính lỗ lọc 11cm. Bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc đƣợc tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc 0,45µm. Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu. Các mẫu đƣợc lọc qua màng lọc 0,2 µm trƣớc khi cho vào lọ phân tích.
Tiến hành chạy điện di theo điều kiện đã chọn ở mục 3.1.13. Căn cứ vào diện tích pic thu đƣợc trên điện di đồ ta tính ra nồng độ các hoạt chất trong chế phẩm nhƣ trong bảng 3.14
Bảng 3.14. Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg
Mẫu thử
Hàm lƣợng hoạt chất trong 1 viên (mg) % Hàm lƣợng so với trên nhãn
Lamivudin Zidovudin Lamivudin Zidovudin
T1 148,5 304,7 99,0 101,57
T2 153,6 297,4 102,4 99,13
63
Hình 3.21. Điện di đồ định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg
Nhận xét: Chế phẩm đƣợc khảo sát có hàm lƣợng nằm trong khoảng giới hạn định lƣợng cho phép (95%- 105%) ( theo phụ lục 11.1 Dƣợc điển Việt Nam IV)
3.3. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản (CE)
Phƣơng pháp CE là một phƣơng pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và hiệu quả tách cao. Phƣơng pháp có thể xác định đƣợc trên nhiều đối tƣợng khác nhau bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính. Phƣơng pháp có một số đặc điểm cơ bản sau:
- Lƣợng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC.
- Dung dịch điện li nền cũng nhƣ mẫu phân tích thƣờng đƣợc pha trong nƣớc deion và sử dụng rất ít, không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại nên CE rất thân thiện với môi trƣờng và với ngƣời làm phân tích.
- Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh hơn nhiều so với phƣơng pháp HPLC.
- Có thể can thiệp trực tiếp các loại cơ chế tách một cách đơn giản bằng cách thêm vào các chất phụ gia cần thiết.
Tuy nhiên phƣơng pháp cũng có một số nhƣợc điểm sau:
- Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phƣơng pháp thấp hơn nhiều so với phƣơng pháp khác. Giới hạn của nó khoảng cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD. Trong khi đó các phƣơng pháp khác nhƣ: HPLC có giới hạn nhỏ hơn nhiều.
64
- Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc.
- Lƣợng mẫu sử dụng nhỏ là một ƣu điểm của phƣơng pháp, đồng thời cũng là nhƣợc điểm của nó. Khi lƣợng mẫu nhỏ và không tập trung dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lƣợng lớn do hệ số pha loãng cao. Đối với mẫu có hàm lƣợng nhỏ, khi tăng thời gian bơm mẫu thì gây ra hiện tƣợng doãng pic, hiệu suất tách không cao.
- Thời gian lƣu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm, dung dịch điện ly vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ.
3.4. Hƣớng phát triển của đề tài.
Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng đồng thời một số hoạt chất kháng HIV trong mẫu chế phẩm thuốc. Phƣơng pháp còn có thể đƣợc mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau ví dụ nhƣ: mẫu máu, mẫu nƣớc tiểu,...Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển phƣơng pháp áp dụng vào thực tiễn hơn. Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu sản xuất các thuốc HIV trong phối hợp điều trị.Hiện nay, nƣớc ta đã sản xuất đƣợc thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Đây là một phƣơng pháp đóng góp cho công tác kiểm tra chất lƣợng thuốc đang lƣu hành và sử dụng.
65
KẾT LUẬN
Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và định lƣợng một số hoạt chất kháng HIV sử dụng phối hợp điều trị trong chế phẩm thuốc, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
1. Đã chọn đƣợc phƣơng pháp phân tích một số hoạt chất kháng HIV với yêu cầu chuẩn bị mẫu đơn giản, dung môi sử dụng là các muối vô cơ, chất hoạt động bề mặt đơn giản là SDS nên rất đơn giản, ít tốn kém và ít độc hại. Chuẩn bị mẫu bằng hòa tan trực tiếp nên tiến hành nhanh chóng và ít sai số.
2. Khảo sát và chọn đƣợc thông số tối ƣu cho quá trình điện di Detector: DAD
Số đo bƣớc sóng chung: Lamivudin 270nm, Zidovudine 264,5 nm và Nevirapin 268,5nm
Kích thƣớc mao quản : Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64,5cm, chiều dài hiệu dụng 60 cm, đƣờng kính trong 75µm, loại bubble cell.
Chất tạo mixen : SDS.
Phƣơng pháp bơm mẫu : Thủy động học 50mbar/5s. Thế điện di: 20kV
Dung dịch điện ly nền : Na2B4O7 10mM + SDS 50mM, pH = 9,30. Nhiệt độ : 250C
3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
- Phƣơng pháp đạt tính tƣơng thích hệ thống với RSD <2% và Rs >1,5.
- Phƣơng pháp có tính đặc hiệu ( tính chọn lọc) cao.
- Khoảng tuyến tính của chất phân tích rộng : 3TC (77,25- 231,7 µg/ml) với r=0,996 ; NVP (99,25- 297,7 µg/ml) với r= 0,998 ; AZT (149,0- 447,0 µg/ml) với r= 0,998 ; đã xử lý thống kê để khẳng định không có sai số hệ thống.
- Xác định LOD, LOQ dựa vào đƣờng chuẩn : 3TC có LOD= 10,02µg/ml và LOQ= 33,41µg/ml ; AZT có LOD= 14,55 µg/ml và LOQ= 48,52 µg/ml ; NVP có LOD= 9,85 µg/ml và LOQ= 32,83 µg/ml.
66 - Phƣơng pháp có độ lặp lại cao RSD < 2%.
- Phƣơng pháp có độ đúng cao, độ thu hồi nằm trong khoảng 98%- 102% 4.Phân tích hàm lƣợng trong viên nén
-Với viên nén 3 thành phần dƣợc chất, hàm lƣợng 3TC từ 98,87%- 102,87% ; NVP từ 100,4%- 102,5% ; AZT từ 95,47%- 99,43% so với hàm lƣợng trên nhãn, nằm trong giới hạn cho phép 95% → 105% (Theo Dƣợc điển Việt Nam IV).
-Với viên nén 2 thành phần dƣợc chất, hàm lƣợng 3TC từ 99,0%- 102,4% ; AZT từ 99,13%- 101,57% so với hàm lƣợng trên nhãn, nằm trong giới hạn cho phép 95%- 105% ( Theo Dƣợc điển Việt Nam IV).
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Một số đặc điểm và ứng dụng của điện di mao quản, Chuyên đề chuyên sâu 3 của nghiên cứu sinh, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
2. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y Tế (2004), Dược thư quốc gia Việt Nam, xuất bản lần thứ ba, nhà xuất bản Y học.
4. Bộ Y Tế (2007), Dược thư quốc gia Việt Nam bản bổ sung, xuất bản lần thứ nhất, nhà xuất bản Y học.
5. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam 4, nhà xuất bản Y học. 6. Bộ Y Tế (2007), Kiểm nghiệm thuốc, nhà xuất bản Y học. 7. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích 1, nhà xuất bản Y học. 8. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích 2, nhà xuất bản Y học. 9. Bộ Y Tế (2008) , Tạp chí Dược học, số 385 năm 48, tr 38-42.
10. Bộ Y Tế (2012), Báo cáo tổng kết công tác phòng, chống HIV- AIDS 6 tháng đầu năm và định hướng kế hoạch 6 tháng cuối năm 2012, số 612/BC- BYT. 11.Bộ Y Tế (2011), Chiến lược quốc gia phòng chống HIV/AIDS đến năm 2020 và
tầm nhìn 2030, Ủy ban quốc gia phòng chống HIV/AIDS và phòng chống tệ nạn ma túy, mại dâm
12.Nguyễn Hữu Chí (2006), Hiệu quả và dung nạp của Stavidine, Lamivudine, Nevirapin ở bệnh nhân nhiễm HIV/ AIDS điều trị tại bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh.
13.Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao, Sách chuyên đề cho sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, ĐH Quốc Gia Hà Nội. 14.Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH
Quốc gia Hà Nội.
15.Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật Phân tích Điện di , Sách chuyên đề cao học). Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.
68
16.Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trƣờng ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội.
TIẾNG ANH
17. A.K. Hemanth Kumar, V.Sudha, Soumya Swaminathan & Geetha Ramachandran (2010), „‟Comparison of HPLC & spectrophotometric method for estimation of antiretroviral drug content in pharmaceutical products‟‟, Indian J Med Res, 132, pp. 390- 394.
18. Arthur L.L. Silva (2012), Journal of pharmaceutical sciences, vol.101 (1), pp.12.
19. Hammer S. M. (2006), “Treatment for Adults HIV infection 2006 Recommendations of the international AIDS Society - USA Panel”, The journal of American medical Association, pp.827-843.
20. Heifer D. (2000), High performance capillary electrophoresis, Agilent Technologies, pp.61-77.
21. Hiren.N.Mistri, ArvindG.Jangid, Ashutosh Pudage, Noel Gomes, Mallika, Sanyal, Pranav, Shrivastav(2007), “High throughput LC-MS/MS method for simultaneous quantification of Lamivudine, stavudine and Nevirapine in human plasma”, Journal of Chromatography B, volum 853, p320-332.
22. Namita Kapoor, Sateesh Khandavilli, Ramesh Panchagnula(2006); Anylytica Chimica Acta;Volum 570, Issue1,p. 41- 45.
23.Mikaela Malm(2008), Drug Analysis Bioanalytical Method Development and Validation; p.23- 25.
24. Ramaiya Sekar, Srinivasan Azhaguvel (2008), “MEKC Determination of Antiretroviral Reverse Transcriptase Inhibitors Lamivudine, Stavudine and Nevirapine in Pharmaceutical Formulations‟‟, Chromatographia, (67), pp.389- 398.
25. Shintani H.; Pholonsky J. (1997), Handbook of capillary electrophoresis application, Blackie academic & professional, p.158.
69
26.SekarR, Azahaguvels (2005), “Simultaneous determination of HIV- protase inhibitors lamivudin and zidovudin in pharmaceutical formulations by micellar electrokinetic chromatography”, Journal of Pharmaceutical and biomedical analysis, India, p.653-660.
27. Sokalingam Anbazhagan (2005), “Simultaneous quantification of Stavudine, Lamivudine and Nevirapine by UV spectroscopy, reverse phase HPLC and HPTLC in tablets”, Journal of Pharmacy and Biomedical Analysis, Volum 39, Issues 3-4, Pages 801-804.
28.Weerasak Samee, Paron Srilamai, Sasithorn Ongart, Ritthichai Suwannaratana, Chayanid Sornchaithawatwong, Suwanna Vorarat (2007), „‟Simultaneous Determination of Lamivudine, Stavudine and Nevirapine in the Presence of Their Acid- Induced Degradation Products by HPLC‟‟, Thai Pharmaceutical and Science Journal, ‘Vol. 2, No. 1‟ , pp. 39-45.
29.Interscience Dublication Johnwiley & sons,inc, Cappilary Electrophoresis method for A wiley , Newyork/ Chichester/ Weinheim/ Brisbane/ Singapore/Toronto. Tr 792, 1297.
30. Laboratory for Analytical Chemistry University of Amsterdam (1996), CE Amsterdam Summercourse.
31.Norbert to A Guzman, Capillary Electrophoresis Technology, Tập 1,2,3. The R.W Johnson Pharmaceutical Reseach Institute Raritan, New Jersey.
32.UNAIDS ( 2002 ) Report on the global HIV/ AIDS Epidemic.