Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích. Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ƣu nhất để tách và định lƣợng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Từ phƣơng pháp đã xây dựng đƣợc, tiến hành kiểm tra chất lƣợng các thuốc có cùng hoạt chất đang đƣợc sử dụng trên thị trƣờng.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Hai kỹ thuật đƣợc lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện di nào có thể tách tốt các hoạt chất.
Sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện để chọn chƣơng trình điện di thích hợp, cụ thể là:
27 - Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp.
- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ƣu tách 3 hoạt chất và định lƣợng đồng thời nhƣ: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ….
- Đánh giá thống kê phƣơng pháp phân tích - Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc - Đánh giá ƣu khuyết điểm của phƣơng pháp
2.2.2.1. Thẩm định phương pháp:
Phƣơng pháp phân tích đang xây dựng đƣợc thẩm định theo các tiêu chí:
Khoảng tuyến tính
Để đảm bảo sự chính xác của phép định lƣợng, chúng tôi tiến hành trên 5- 7 mẫu hỗn hợp chuẩn cần phân tích ở các nồng độ khác nhau, lập mối tƣơng quan giữa nồng độ của Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin với diện tích pic thu đƣợc trên điện di đồ bằng phƣơng trình hồi quy cùng các hệ số tƣơng ứng và đồ thị.
Yêu cầu đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và giá trị hệ số tƣơng quan r 0,99.
Độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành phân tích ở mức nồng độ đã xác định với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic của ba chất cần phân tích. Đánh giá độ phân tán số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD(%)
RSD(%)=
x SD
x 100
Yêu cầu RSD(%) không đƣợc quá 5%.
Độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã đƣợc cho thêm những lƣợng chuẩn nhất định. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành lặp lại sáu lần, chuẩn thêm vào 20% so với lƣợng có trong mẫu. Phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:
28
Mẫu thử: là dung dịch chế phẩm đƣợc pha với hệ đệm ở nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Hệ đệm chúng tôi dùng trong nghiên cứu này là nƣớc cất deion và 10% Metanol (v/v)
Mẫu thêm chuẩn: đƣợc tiến hành song song cùng mẫu thử, thêm 20% chuẩn so với hàm lƣợng có trong mẫu.
Tính độ thu hồi: Dựa vào phƣơng trình chuẩn hồi quy tính toán đƣợc nồng độ của từng mẫu (Cmẫu ) và nồng độ của từng mẫu thêm chuẩn (Cmẫu thêm chuẩn).
Cthu hồi = Cmẫu thêm chuẩn- Cmẫu
Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%)=Cthu hồi/ Cchuẩn
Tính tương thích hệ thống
Tính tƣơng thích hệ thống đƣợc xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu hỗn hợp ba chuẩn đã đƣợc xác định nồng độ. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD(%) và giá trị độ phân giải Rs của hai pic.
Rs = 2 x [(tR)B- (tR)A] / (WA+WB)
Trong đó (tR)A: thời gian dịch chuyển của chất A (tR)B : thời gian dịch chuyển của chất B
WA, WB : độ rộng chân pic trên điện di đồ của hai chất A và B
Tính đặc hiệu của phương pháp
Tính đặc hiệu của phƣơng pháp là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt của các chất cần phân tích khi có các thành phần khác bằng cách điện di lần lƣợt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử trong cùng một điều kiện điện di đã lựa chọn. Trong đó mẫu trắng chính là dung môi (trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nƣớc deion và 10% metanol (v/v) làm dung môi) đã dùng để pha mẫu thử và mẫu chuẩn.
2.2.2.2. Áp dụng phương pháp đã nghiên cứu vào định lượng các loại viên nén 2 hoạt chất và 3 hoạt chất.
Trên cơ sở đã khảo sát, chọn nồng độ định lƣợng của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính.
29
Từ đƣờng chuẩn đã xây dựng đƣợc khi xác định khoảng tuyến tính, tính ra đƣợc hàm lƣợng chất cần phân tích có trong mẫu định lƣợng. Tiếp đó tính ra hàm lƣợng hoạt chất có trong chế phẩm.
30
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC, AZT và NVP 3.1.1. Chọn bƣớc sóng phát hiện chất
Để khảo sát phổ 3TC,AZT và NVP, detector đƣợc chọn là DAD. Do 3 hoạt chất đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm để xác định các bƣớc sóng hấp thụ tối ƣu của các chất này. Các chất đƣợc pha với nồng độ 120µg/ml trong 10 mM đệm Borat, 50 mM SDS, pH=9,3. Phổ thu đƣợc thể hiện hình 3.1.
3TC
31
Hình 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP
Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhƣợc điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hƣởng
Kết quả quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 270,5nm, Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 264,5nm và Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 268,5nm.Chúng tôi chọn các bƣớc sóng hấp thụ cực đại cho từng chất trong phép định lƣợng để cho kết quả chính xác nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP.
3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản
Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đƣờng kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hƣởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thƣớc mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lƣợng nhỏ nhƣ mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đƣờng kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hƣởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đƣờng kính trong của mao quản thƣờng là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đƣờng kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thƣờng cho hiệu ứng nhiệt Jun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đƣờng kính trong là 75 µm .
32
Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thƣờng đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản silica trần, có tổng chiều dài là 64,5cm, chiều dài hiệu lực là 60 cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thƣờng) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 60 cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di.
Điều kiện rửa mao quản: trong thời gian tiến hành điện di, mao quản đều đƣợc rửa để phục hồi và duy trì bề mặt mao quản ổn định, giảm sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt mao quản, làm mới lại bề mặt để tạo điều kiện cho silanol điện ly, tạo bề mặt mao quản mang điện tích.
Thời điểm bắt đầu : lần lƣợt rửa bằng nƣớc deion 5 phút, dung dịch NaOH 1M 10 phút , dung dịch NaOH 0,1 M 5 phút và rửa lại bằng nƣớc deion 10 phút (tất cả các dung dịch trƣớc khi chạy đều đƣợc lọc qua màng lọc 0,2µm).
Giữa các lần chạy: 2 phút nƣớc cất deion- 1 phút NaOH 0,1 M – 1 phút nƣớc cất deion– 2 phút dung dịch đệm.
Thời điểm kết thúc: lần lƣợt rửa bằng nƣớc cất deion 5 phút, dung dịch NaOH 0,1M 5 phút, nƣớc cất deion 10 phút.
3.1.3. Chọn phƣơng pháp bơm mẫu
Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đƣa vào mao quản bằng ba phƣơng pháp là phƣơng pháp điện động học (electrokinetic), phƣơng pháp thủy động học (hydrodynamic) và phƣơng pháp Xiphong (siphon). Trong đó phƣơng pháp điện động học và thủy động học đƣợc dùng rộng rãi. Nguyên tắc của phƣơng pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một
33
điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng đƣợc nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Nhƣ thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thƣớc nhỏ, điện tích lớn sẽ đƣợc dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhƣng điện tích khác nhau thì lƣợng ion của những chất này đƣợc dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích đƣợc nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này không đáng ngại vì ngƣời ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện nhƣ nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hƣởng đến độ nhạy. Ngoài ra lƣợng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trƣớc đƣợc nhƣ những mẫu nƣớc tiểu.
Trong phƣơng pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phƣơng pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản đƣợc đặt cao thấp khác nhau một khoảng H, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Nhƣ thế mẫu nạp vào đƣợc đặt ở đầu mao quản cao. Phƣơng pháp này đơn giản nhƣng khi nạp một lƣợng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít đƣợc dùng.
Phƣơng pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lƣợng mẫu sẽ đƣợc bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay đƣợc dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu đƣợc bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phƣơng pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phƣơng pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ đƣợc dùng trong suốt quá trình thí nghiệm
34
Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò nhƣ pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen đƣợc hình thành bởi các phân tử SDS.
Theo lý thuyết, độ điện di [7,8]
tot(i) = ( ef + EOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14) Thời gian lƣu của chất tan i là:
ti = (L.l)/(tot(i) .V) (15) Trong đó:
tot(i) = (ef + EOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan. V: Điện thế đƣợc dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV.
l: Chiều dài hiệu dụng (60 cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm).
E: Điện trƣờng trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trƣờng E này do thế V (kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di
của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản.
Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan đƣợc tính theo công thức sau:
µef = tot - EOF
µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 60/ ti .V
EOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 60/ t0 . V
Thời gian t0 đƣợc đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 đƣợc xác định bằng cách điện di metanol tinh khiết.
3.1.5 Lựa chọn cơ chế tách
Tiến hành chạy điện di hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên 3 loại
35
dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM; Na2B4O7 10mM + SDS 50mM ; Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM.
Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C
Các điện di đồ thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC
Nhận thấy nếu chỉ dùng phƣơng pháp điện di mao quản vùng (CZE) thì không tách đƣợc 3 chất ra khỏi nhau. Vì pKa của Lamivudin (pKa= 3,31 ) và Nevirapin (pKa= 2,42) khá gần nhau. Trong dung dịch điện ly nền với khoảng pH nhất định thì 2 chất
Na2B4O7 10mM
Na2B4O7 10mM + SDS 50mM
Na2B4O7 10mM + β-CD 10mM.
36
này bị ion hóa giống nhau, 2 chất đi ra khỏi mao quản trong cùng một thời điểm nên trên điện di đồ chỉ xuất hiện 2 pic mà thôi.
Thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm (SDS) thì độ phân giải giữa 3 chất tăng rõ rệt. Cả 3 chất đƣợc tách rõ ràng trên điện di đồ. Vì mỗi chất sẽ có sự phân bố vào Pha tĩnh giả SDS khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau. Nhƣ vậy các hoạt chất này sẽ tách đƣợc theo cơ chế MEKC.
Còn khi thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất chọn lọc đối quang β- CD thì trên điện di đồ cũng chỉ xuất hiện 2 pic có nghĩa là yếu tố không gian của 3 chất này không ảnh hƣởng tới quá trình tách. Chất hoạt động bề mặt β- CD không đƣợc lựa chọn.
Chọn phƣơng pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt là SDS đối với các khảo sát còn lại cho các hoạt chất này.
3.1.6. Ảnh hƣởng pH của dung dịch điện li nền
Ảnh hƣởng pH trong dung dịch đệm điện di đƣợc khảo sát với dung dịch điện di chứa:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM + SDS 50mM
- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C
Gía trị pH thay đổi tại pH = 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17.
37
Hình 3.3. Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17
Vì mao quản đƣợc sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 8,76 đến 10,17 (>4), bề mặt
pH= 9,06
pH= 9,30
pH= 9,62
38
mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thƣờng hƣớng theo phƣơng từ anốt (cực dƣơng) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dƣơng) nghĩa là ngƣợc chiều với hƣớng của dòng EOF.