1.3.3.1. Những nghiên cứu trên thế giới
Dân số thế giới đã đạt đến con số kỷ lục 6 tỷ người và nó được dự đoán sẽ tăng lên 8 tỷ người vào năm 2025 và gấp đôi vào những năm 2050. Do vậy vấn đề cung cấp lương thực cũng như các nguyên vật liệu khác cho nhu cầu sinh hoạt của con người trong những thập niên tới là một thách thức rất lớn đối với toàn nhân loại. Các phương pháp chọn giống truyền thống sẽ khó có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp thực phẩm cho con người trong tương lai. Để đáp ứng được nhu cầu đó, trong những thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ biến đổi gen đã đem lại một bước nhảy vọt không những trong việc tăng năng suất và chất lượng cây trồng như tạo giống năng suất cao, chống bệnh sâu hại, chống chịu khí hậu lạnh, khô hạn và thiếu nguồn dinh dưỡng, kháng thuốc trừ cỏ…mà còn cải thiện được môi trường như giảm hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật, giảm lượng phân bón….
Vì mang lại những lợi ích ổn định và bền vững về kinh tế, môi trường, làm tăng sản lượng nông nghiệp, cải thiện đời sống của người nông dân, cây trồng biến đổi gen hay gọi là cây trồng CNSH ngày càng được trồng nhiều hơn trên toàn cầu. Tính đến hết năm 2009 diện tích trồng cây CNSH đã tăng lên 134 triệu ha, tăng 7% so với năm 2008. Diện tích trồng cây CNSH ở các nước đang phát triển tăng 13% vào năm 2009, so với 3% ở các nước công nghiệp. Trong tổng số 25 quốc gia trồng cây CNSH thì Hoa Kỳ là nước trồng cây này lớn nhất thế gới (64 triệu ha), tiếp theo là các nước như Barzil, Argentina, Ấn độ, Canada, Trung Quốc, Paraguay và Nam Phi [37]. Tại các quốc gia này, cây CNSH chủ yếu được sử dụng là cây ngô, đậu tương, và cây bông được chuyển gen kháng sâu (Bt). Từ những thành quả đem lại đã cho thấy sự tin cậy của hàng triệu nông dân trên thế giới đối với cây trồng CNSH. Một trong những thành quả mà cây trồng CNSH đem lại đó là tại Ấn Độ,
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
trong khoảng thời gian từ năm 2002 đến 2008, tổng lợi nhuận kinh tế mà cây bông biến đổi gen Bt mang lại là 5,1 tỷ USD. Hơn thế nữa, các giống bông Bt cũng làm giảm một nửa lượng thuốc trừ sâu cần sử dụng, và làm tăng gấp đôi thu hoạch, điều này chuyển Ấn Độ từ nước nhập khẩu bông thành nước xuất khẩu bông lớn nhất thế giới. Tại Phillipine, giống ngô biến đổi gen đã được trồng khảo nghiệm và sau đó được trồng rộng rãi, với diện tích trồng ngô biến đổi gen (kháng sâu đục thân châu Á) từ 10 769 ha (năm 2003) lên đến 81 652 ha (năm 2008).
Trong lĩnh vực Lâm nghiệp, cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu. Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu, và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi lê và Trung Quốc. Mục đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên quan đến tăng sinh khối, chống chịu sâu bệnh và điều kiện khô hạn, giảm hàm lượng lignin, tăng hàm lượng và độ dài sợi cellulose, mang lại lợi ích to lớn cho ngành công nghiệp giấy cũng như cải tạo môi trường tại những vùng đất suy thoái thiếu chất dinh dưỡng…
Hiện tại, số lượng các gen được xác định trình tự ở loài bạch đàn là rất ít, nếu so với Arabidopsis thaliana. Cho đến nay, mới chỉ có khoảng 4000 trình tự gen được tìm thấy ở loài bạch đàn (bao gồm cả trình tự của ribosome và lục lạp). Trong đó chủ yếu các gen được phân lập và xác định các đặc tính là các gen liên quan đến các đặc tính có giá trị kinh tế như các gen liên quan đến quá trình hình thành gỗ, quá trình nở hoa của cây, quá trình hấp thu dinh dưỡng cũng như tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, chống chịu sâu bệnh [46]. Xây dựng thư viện cDNA, EST và xác định biểu hiện của gen là công cụ cần thiết cho nghiên cứu các tính trạng quan trọng của cây. Sau khi gen cho tính trạng cần nghiên cứu đã được xác định, việc phân tích các biểu
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
hiện của gen trong quá trình sinh học phát triển là cần thiết làm tiền đề cho các nghiên cứu về thao tác di truyền và chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử.
Với cây rừng, xây dựng thư viện cDNA cho trình tự ESTs (sequencing for Express Sequence Tag) gần đây bắt đầu được nghiên cứu. Mehta và cộng sự 2005 đã bước đầu nghiên cứu thiết lập thư viện EST cho cây đước Ấn Độ để nghiên cứu mối tương quan giữa gen với tính chịu mặn. Jun-ichiro và cộng sự (1997) cũng đã lập thư viện cDNA cho các gen biểu hiện về sự phân hóa xylem trong quá trình hình thành độ kéo căng của gỗ bạch đàn camal. Năm 1998, Isabel allona và cộng sự cũng đã xây dựng thư viện cDNA và EST cũng như xác định một số gen và biểu hiện của nó trong quá trình hình thành gỗ của thông taeda (Pinus taeda). Một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin, cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài bạch đàn Eucalyptus globulus [46]; E. gunnii [40]; E. camaldulensis [37]; E. grandis [43]. Các gen liên quan đến tăng khả năng hấp thụ lân cũng đã được
phân lập từ bạch đàn trắng tại Nhật Bản, trong số 5 gen được phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và giàu lân [49]. Các gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulo đã được phân lập và nghiên cứu [43]. Bảy gen mã hóa sinh tổng hợp cellulo đã được phân lập từ bạch đàn grandis các gen này được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lượng cũng như độ dài sợi gỗ.
1.3.3.2. Những nghiên cứu trong nƣớc
Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học trong nông, lâm nghiệp phát triển mạnh mẽ tại Việt Nam. Công nghệ biến đổi gen cũng đã có những bước đi quan trọng trong quá trình phát triển khoa học công nghệ tại Việt Nam và được nhà nước quan tâm, đầu tư. Nhiều chương trình, dự án, đề tài nghiên cứu đã được triển khai. Một số đề tài nghiên cứu phân lập gen có ý nghĩa kinh tế và tạo cây trồng chuyển gen đã được phê duyệt trong những năm gần đây. Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu tạo cây chuyển gen đang
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
tập trung chủ yếu vào khâu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen thông qua việc chuyển các gen chỉ thị [21], [26]. Các phương pháp chuyển gen đã được sử dụng như Súng bắn gen, vi khuẩn Agrobacterium để biến nạp gen vào các cây trồng khác nhau là lúa, đậu xanh, hồng, thuốc lá, cải bắp [5], [21], [26], [27]. Một số tác giả đã tiến hành phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế vector biểu hiện và nghiên cứu biểu hiện gen [3], [6], [14], [15]. Tuy nhiên hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung cho cây nông nghiệp như lúa (chuyển gen chịu hạn, chuyển gen có hàm lượng vitamin A cao), đậu tương (chuyển gen kháng sâu và kháng hạn), ngô (chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu), bông (chuyển gen kháng sâu và chịu hạn), đu đủ (chuyển gen kháng virus đốm vòng)...
Trong lĩnh vực lâm nghiệp, nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen vẫn còn là khá mới mẻ tại Việt Nam. Trong những năm cuối của thập niên 90, cây bạch đàn chuyển gen làm giảm hàm lượng lignin đã được trồng thử nghiệm đầu tiên ở Việt Nam do Viện khoa học lâm nghiệp phối hợp với công ty giấy Oji của Nhật thực hiện, tuy nhiên đây chỉ là nghiên cứu ban đầu và đánh giá tác động của cây biến đổi gen đến môi trường. Gần đây, trong khuôn khổ chương trình trọng điểm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, đã có 2 đề tài thực hiện nghiên cứu chuyển gen cho cây xoan (chuyển gen tăng cường sinh trưởng) và thông nhựa (chuyển gen kháng sâu bệnh). Sau gần 5 năm thực hiện, 2 đề tài này đã có kết quả bước đầu khả quan. So với số lượng các đề tài nghiên cứu về chuyển gen cây nông nghiệp thì cây lâm nghiệp còn chưa nhiều, do vậy, việc phát triển các nghiên cứu về chuyển gen cho cây lâm nghiệp, nhất là đối với một số tính trạng có giá trị kinh tế là việc làm cần thiết và cần sớm thực hiện.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
1.3.3.3. Một số trở ngại và phƣơng hƣớng giải quyết trong tạo cây lâm nghiệp biến đổi gen
Cây lâm nghiệp nhất là những cây có giá trị cao đều là cây thân gỗ, có chu kỳ sống nhiều năm. Vì thế, nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học để chuyển gen vào đối tượng này thương gặp phải nhiều khó khăn so với cây nông nghiệp, cây công nghiệp ngắn ngày.
+ Nếu tái sinh cây in vitro xuất phát từ hạt, nhiều loại hạt có vỏ cứng,
thời gian nghỉ dài nên để hiệu quả cao phải kèm theo các phương pháp xử lý thích hợp. Các phương pháp này có thể là dùng nhiệt độ cao như ở 100oC với cái loài Keo, hay với nhiệt độ thấp như loài Thông hay phải tách lấy phôi như hoạt Xoan. Với các loài hạt có vỏ cứng như Xoan ta, Keo, Lim, Trám... có thể dùng axit đậm đặc để phá ngủ; hoặc nếu cần thiết có thể sử dụng hormone như gibberillin để điều khiển cân bằng hormone gibberillin/axit abscisic thiên về hormon kích thích nẩy mầm làm mất tác dụng của hormone kịch thích ngủ nghỉ như axit abscisic, nhằm rút ngắn thời gian nẩy mầm cho hạt.
+ Trong nhân giống in vitro truyền thống hay sử dụng hệ thống
bioreactor để nhân nhanh cây lâm nghiệp phục vụ sản xuất hoặc phục vụ cho cây chuyển gen thì việc chọn dòng cây trội có nhiều ưu điểm làm nguyên liệu ban đầu là một vấn đề quan trọng. Để tiến hành theo hướng này thì nguyên liệu vào mẫu ban đầu phải xuất phát từ các đoạn thân non chứa chồi ngủ hay chồi ngọn của các cây trội hay các cây lai có ưu thế lai cao trồng ngoài thực địa nên khâu vào mẫu ban đầu được xem là khá khó khăn. Việc tìm được các công thức môi trường cho từng giai đoạn phát triển của cây in vitro đòi hỏi
nhiều thời gian và công sức. Để khắc phục khó khăn này thì việc tham khảo các công trình nghiên cứu trước đó trên cùng một đối tượng hoặc các loài cây có quan hệ họ hàng thân thuộc trong bảng phân loại là một hướng đi đúng đắn để rút ngắn thời gian nghiên cứu mò mẫm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
+ Ở cây thân gỗ, tuổi ra hoa thường là dài, với Xoan ta, Keo, Bạch đàn nếu sinh trưởng thuận lợi thì thời gian này cũng phải mất từ 2 - 3 năm. Vì vậy, để thuận lợi hơn cho việc nghiên cứu phân tích cây chuyển gen qua các hệ sinh sản hữu tính thì một trong các phương pháp là sử dụng các hormone kích thích ra hoa. Trong quá trình ra hoa của thực vật, gibberillin có khả năng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mầm hoa để tạo ra hoa. Có tác giả còn cho rằng gbberillin là một thành phần của hormone ra hoa. Thực nghiệm chỉ ra rằng gibberilin có thể rút ngắn được thời gian ra hoa, làm cho cây hai năm ra hoa ngay trong năm đầu. Giberillin còn kích thích cây ngày dài ra hoa trong điều kiện ngắn ngày. Vì vậy, bổ sung gibberillin ngoại sinh khi cây trưởng thành có thể sẽ kích thích cây ra hoa sớm. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là phải tìm ra được nồng độ thích hợp của hormone để việc xử lý có hiệu quả cao.
+ Cây lâm nghiệp chuyển gen có nhiều lo ngại về ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Cây rừng thường sống ngoài tự nhiên trên diện tích rộng lớn, vì vậy chúng có quan hệ mật thiết với các loài lân cận. Ảnh hương của cây lâm nghiệp chuyển gen đến môi trương xung quanh là vấn đề mà các nhà khoa học cần quan tâm. Để hạn chế các ảnh hưởng này người ta có thể tiến hành khoanh vùng và có các biện pháp quản lý thích hợp đối với khu vực trồng cây chuyển gen. Không trồng cây chuyển gen một cách tự phát, không có kiểm soát để hạn chế tối đa việc phát tán các gen chuyển từ cây chuyển gen sang các loài thực vật khác gây ảnh hưởng xấu đên môi trường sinh thái.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
2.1.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là hạt giống bạch đàn urô do trung tâm Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam cung cấp.
2.1.1.2. Vật liệu chuyển gen
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 mang vector pGWB2 có kích thước khoảng 17 kb chứa gen EcHB1 do Trung tâm Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
Hình 2.1. Cấu trúc vector pGWB2 chứa gen EcHB1
2.1.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng
- Thiết bị: bao gồm các loại box cấy vô trùng; nồi khử trùng; máy nước cất một lần, hai lần; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel; tủ ấm; tủ lắc; dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,...
- Hóa chất:
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây bạch đàn urô là môi trường MS cơ bản; các chất điều hòa sinh trưởng: BAP, Kin, IBA và NAA; các chất kháng sinh như: kanamycin, cefotaxime ... được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh), Amerham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani)
- Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh hoc, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo mẫu bạch đàn sạch in vitro
+ Thu mẫu và xử lý mẫu: mẫu sau khi thu về, quả được phơi khô, sau vài ngày thì tách ra lấy hạt. Cho hạt vào bình thủy tinh rửa sạch bằng cách lắc mạnh với nước xà phòng loãng trong 20 phút, sau đó loại bỏ mày bám trên hạt và rửa hạt lại bằng nước máy nhiều lần. Hạt sau khi rửa lại bằng nước nhiều lần được sấy khô hoặc tiến hành vào mẫu ngay lúc đó.
+ Hạt bạch đàn được khử trùng theo công thức:
- Hạt bạch đàn được sát khuẩn bằng cồn 70% trong thời gian 1 phút, loại bỏ cồn, rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó khử trùng tiếp bằng Javel 30% trong thời gian 10 - 30 phút loại bỏ Javen, rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần.
Hạt bạch đàn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung thêm 30 g/l đường và 8 g/l agar, pH 5,8. Để trong tối, điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy 25o
C, trong thời gian 5 ngày. Sau 5 ngày trong tối, hạt bắt đầu nảy mầm và chuyển cây mầm nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2.500 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng nhóm cytokinin đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo
Thân và lá mầm được cắt thành những mảnh nhỏ, đặt ngay lên môi trường nuôi cấy (CT1-12) với các thành phần môi trường: MS + BAP + kinetin