Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2000 lux, chu kỳ 16 giờ sáng, 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 26 ± 2oC. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng phần mềm Excel.
+ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = x 100%
+ Tỷ lệ mẫu sạch= x 100%
+ Tỷ lệ mẫu nẩy mầm = x 100%
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro
Đây là giai đoạn đầu tiên có vai trò quan trọng nhằm cung cấp cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống in vitro. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ phôi hạt nẩy mầm cao và tỷ lệ mẫu sạch cao. Để đáp ứng được như trên thì các mẫu phôi hạt lấy từ ngoài môi trường tự nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi trường nuôi cấy. Thông thường mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn.
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy với thời gian khử trùng khác nhau đã đem lại hiệu quả khác nhau về các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nẩy mầm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Kết quả tạo mẫu bạch đàn sau 7 ngày nuôi cấy Hóa chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu cấy Mẫu nhiễm Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu sạch (%) Mẫu nẩy mầm Tỷ lệ nảy mầm (%) NaOCl 30 10 100 55 45 45 37 37 20 100 25 75 75 51 51 30 100 13 87 87 42 42
Dựa vào bảng kết quả cho thấy: khi sử dụng Javen 30% ở thời gian khử trùng tăng lên mẫu nhiễm giảm nhưng mẫu chết tăng lên. Cụ thể tương ứng với các thời gian khử trùng 10 phút, 20 phút, 30 phút có các tỷ lệ mẫu nhiễm là 55%, 25%, 10%, tỷ lệ mẫu sạch là 45%, 75%, 87%. Đồng thời khả năng nẩy mầm của phôi cũng chịu ảnh hưởng của thời gian khử trùng. Khi thời gian khử trùng tăng lên thì khả năng nẩy mầm của phôi giảm. Điều này do nước Javen tương tự như HClO, có tính oxi hóa rất sẽ gây ảnh hưởng lớn tới quá trình nảy mầm của hạt, nếu ngâm hạt trong nước javen trong thời gian dài.
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng với NaOCl 30% đến kết quả tạo mẫu Bạch đàn sạch in vitro từ phôi hạt.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Ở biểu đồ 3.1 cho thấy khử trùng băng Javel 30% với thời gian 10 phút thì tỷ lệ nhiễm cao và tỷ lệ nẩy mầm so với mẫu sạch cho thấy mẫu nẩy mầm cao nhưng mẫu nhiễm nhiều. Ở thời gian 20 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Ở thời gian 30 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhưng số mầm cây không nẩy cao.
Từ hiệu quả khử trùng của Javen 30% theo các mức thời gian như trên, ta thấy sử dụng Javen 30% ở thời gian 20 phút đem lại tỷ lệ mẫu sạch và nẩy mầm tốt nhất.
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
3.2.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng nhóm cytokinin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
Phôi hạt sau khi nuôi cấy 5 ngày trên môi trường MS phát triển thành cây mầm. Các lá mầm và thân mầm được cắt thành các mảnh nhỏ cấy lên các công thức môi trường tái sinh (CT1-12).
Sau 4 tuần nuôi cấy, tiến hành thu thập, đánh giá, xử lý số liệu và kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đến khả năng tái sinh
CTNC
Số mẫu
cấy
Số mẫu tái sinh trực tiếp (số mẫu/%)
Số chồi /mẫu
Số mẫu tái sinh từ mô sẹo (số mẫu/%) Số chồi /mẫu ĐC 96 0/0,00 0,00 0/0,00 0,00 CT1 112 15/13,39 1,33 20/17,86 1,33 CT2 125 19/15,20 1,67 27/21,60 1,33 CT3 120 17/14,17 2,00 24/20,00 1,67 CT4 128 18/14,06 1,33 19/14,84 1,67 CT5 112 19/16,96 1,67 20/17,86 1,67 CT6 112 17/15,18 2,00 19/16,96 2,33 CT7 112 21/18,75 3,33 23/20,54 3,67 CT8 128 30/23,44 4,00 31/24,22 3,67 CT9 112 20/17,85 3.33 27/24,11 3,33
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CT10 128 21/16,41 4,00 30/23,44 3,67
CT11 128 22/17,19 4,33 31/24,22 4.00
CT12 112 19/16,96 3,33 25/22,32 3.67
Kết quả cho thấy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đã thể hiện rõ hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh trực tiếp từ môi sẹo. Ở công thức đối chứng (môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng), 100% các mảnh cấy không có khả năng tạo mô sẹo, còn trên các công thức môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh trực tiếp từ mô sẹo khác nhau. Ở các công thức thí nghiệm với cùng một loại chất điều hòa sinh trưởng nhưng có nồng độ khác nhau và tỷ lệ các chất khác nhau cũng cho kết quả tái sinh trực tiếp và tái sinh từ mô sẹo.
Biều đồ 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Khi sử dụng môi trường bổ sung BAP đơn lẻ ở nồng độ 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,8 mg/l tương ứng với các công thức CT1, CT2, CT3 cho thấy ở công thức CT2 tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 15,20% ở tái sinh trực tiếp và 21,60% ở tái sinh từ mô sẹo (biểu đồ 3.2). Mặt khác,theo quan sát thấy sự hình thành chồi và chất lượng chồi kém nên trung bình số chồi/mẫu ở môi trường có bổ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
sung BAP đơn lẻ rất thấp, cao nhất là 2,00 số chồi/mẫu với tái sinh trực tiếp và 1,67 số chồi/mẫu với tái sinh từ mô sẹo (bảng 3.2).
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Khi sử dụng Kinetin đơn lẻ trên môi trường ở các nồng độ 0,3mg/l; 0,5 mg/l; 0,8 mg/l tương ứng với các công thức CT4, CT5, CT6 cho thấy ở môi trường CT5 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất là 16,96% ở tái sinh chồi trực tiếp và 17,86% ở tái sinh chồi từ mô sẹo (biểu đồ 3.3). Cũng như đối với môi trường BAP đơn lẻ, sự hình thành chồi và chất lượng chồi kém nên trung bình số chồi/mẫu cao nhất là 2,00 ở tái sinh trực tiếp và 2,33 ở tái sinh từ mô sẹo (bảng 3.2).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Nghiên cứu ảnh hưởng khi kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và Kinetin kết quả cho thấy, tỷ lệ tái sinh chồi tăng lên và số chồi trên mành cấy cũng tăng, đa số chồi có chất lượng tốt, cao và đồng đều. Ở công thức môi trường CT8 có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l Kinetin cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (23,44% ở tái sinh chồi trực tiếp và 24,22% ở tái sinh từ mô sẹo) và số chồi/mẫu cao (4.00 chồi/mẫu ở tái sinh trực tiếp và 3,67 chồi/mẫu ở tái sinh tử mô sẹo). Vậy ta chọn công thức môi trường CT8 khi kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và Kinetin cho tái sinh chồi (biểu đồ 3.4).
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của BAP và TDZ đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp Khi sử dụng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và TDZ , hiệu quả tái sinh chồi cao hơn so với sử dụng đơn lẻ BAP nhưng thấp hơn so với tổ hợp BAP + Kinetin. Ở công thức môi trường bổ sung 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l TDZ có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 17,19% ở tái sinh trực tiếp; 24,22% ở tái sinh từ mô sẹo và 4,33 chồi/mẫu ở tái sinh trực tiếp và 4,00 chồi/mẫu ở tái sinh từ mô sẹo (biểu đồ 3.5) (bảng 3.2).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.1. Thân mầm tái sinh chồi sau 5 tuần nuôi cấy
Như vậy trong môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin, thì công thức môi trường CT8 (MS + 0,3 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar) là môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi.
Thực tế khi nghiên cứu cho thấy, sau khoảng 5 - 7 tuần nuôi cấy trong môi trường tái sinh bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin các chồi phát triển chậm lại, thân ngắn ảnh hưởng tới ra cây sau này.
3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trƣởng nhóm auxin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
Các lá mầm và thân mầm sau khi cắt thành những mảnh nhỏ được cấy lên các công thức môi trường tái sinh (C0-10) và được nuôi dưới dàn đèn neon. Sau 4 tuần, kết quả thu thập và xử lý số liệu trình bày ở bảng 3.3.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và nhóm auxin đến khả năng tái sinh chồi
CTNC Số mẫu cấy Số mẫu tái sinh trực tiếp (số mẫu/%) Số chồi /mẫu
Số mẫu tái sinh từ mô sẹo (số mẫu/%) Số chồi/mẫu C0 96 0/0,00 0,00 0/0,00 0,00 C1 112 19/16,96 3,00 19/16,96 3,33 C2 112 20/17,86 3,33 23/20,54 3,00 C3 120 22/18,33 3,33 25/20,83 3,33 C4 112 39/34,82 4,00 44/39,28 4,33 C5 128 39/30,47 3,67 45/35,16 4,00 C6 128 42/32,81 4,00 51/39,84 3,67 C7 112 44/39,29 4,67 50/40,62 4,33 C8 128 47/36,72 3,67 51/39,84 4,00 C9 128 47/36,72 3,33 49/38,28 3,67 C10 128 50/39,06 4,33 50/39,06 4,33 C11 128 47/36,72 3,67 48/37,5 3,33
Từ bảng số liệu thu thập được ở bảng 3.3 cho thấy việc kết hợp BAP với nhóm auxin vào môi trường nuôi cấy đã thể hiện rõ hiệu quả tái sinh. Ở môi trường đối chứng (C0) 100% các mảnh cấy không có khả năng tái sinh, còn trên các công thức môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đã cho kết quả tái sinh với tỷ lệ và tính chất chôi khác nhau. Đặc biệt nó thể hiện khả năng tái sinh cao hơn khi kết hợp nhóm cytokinin và auxin so với nhóm cytokinin.
BAP là chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp nhân tạo thuộc nhóm cytokinin, có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BAP có vai trò rất quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành các chồi non, quyết đinh hệ số nhân vào chất lượng chồi. Ngoài ra BAP còn tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh chồi ở cây gỗ [49].
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của BAP và NAA tới khả năng tái sinh Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA kết quả cho thấy, ở công thức môi trường C4 có bổ sung 0,3 mg/l BAP và 0,2 mg/l NAA có tỷ lệ tái sinh 34,82% ở tái sinh trực tiếp và 39,28% ở tái sinh từ mô sẹo ; có 4,00 chồi/mẫu ở tái sinh trực tiếp và 4,33 chồi/mẫu ở tái sinh từ mô sẹo cao hơn so với các môi trường khác cùng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA (biểu đồ 3.6).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BAP và IBA tới khả năng tái sinh Khi tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và IBA, ta thấy hiệu quả tái sinh chồi khá cao, đa số chồi có chất lượng tốt, cao và đồng đều. Ở công thức môi trường C7 có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l IBA có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất 39,29% và 4,67 chồi/mẫu ở tái sinh chồi trực tiếp; 40,62% và 4,33 chồi/mẫu ở tái sinh chồi(biểu đồ 3.7). Khi quan sát thấy chồi và mô sẹo khi ở môi trường C7 có mầu hồng và tỷ lệ chồi cao, dài và chắc.
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của BAP, NAA và IBA đến khả năng tái sinh Ngoài ra sự tổ hợp của các chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA và IBA thể hiện ở biểu đồ 3.8, môi trường C10 có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 39,06% ở tái sinh trực tiếp; 39,06% ở tái sinh từ mô sẹo và số chồi/mẫu cao nhất là 4,33 ở tái sinh trực tiếp và 4,33 ở tái sinh từ mô sẹo (biểu đồ 3.8) ( bảng 3.3). Theo như quan sát thì chồi tái sinh ở môi trường này khá cao nhưng các chồi tái sinh ở mẫu phát triển chậm, tạo mô sẹo có mầu nâu vàng, hoặc tạo mô sẹo xốp có mầu trắng không có khả năng hình thành chồi hoặc chồi nhỏ và kém phát triển. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Thân mầm tái sinh sau 6 - 7 tuần nuôi cấy
Khi quan sát ảnh hưởng của BAP kết hợp với nhóm điều hòa sinh trưởng auxin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo ở môi trường C7 thích hợp nhất trong các môi trường có công thức C0-11 với tỷ lệ tái sinh trực tiếp cao nhất là 39,29%, trung bình 4,67 chồi/mẫu; tỷ lệ tái sinh từ môi sẹo cao nhất là 40,62%, trung bình 4,33 chồi/mẫu.
Như vậy, trong các công thức môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng, công thức môi trường C7 (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 8g/l agar) là môi trường thích hợp nhất cho việc tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh từ mô sẹo từ mảnh thân, lá mầm bạch đàn urô.
3.2.3. Ảnh hƣởng của NAA và IBA tới khả năng ra rễ của chồi
Trong quá trình nuôi cấy, các chồi hình thành có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải được cấy chuyển sang môi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số loài, các chồi có thể sẽ tạo rễ sau
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
khi được chuyển trực tiếp ra đất. Môi trường kích thích tạo rễ thường bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin.
Auxin là nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần khác của môi trường để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào, điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là phát sinh rễ.