1.3.1. Khái niệm chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiêu gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật,..) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen [25].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ .
1.3.2. Các phƣơng pháp chuyển gen cho cây trồng
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp.
1.3.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp
+ Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện + Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
+ Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn + Chuyển gen nhờ súng bắn gen
+ Chuyển gen nhờ silicon carbide
1.3.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp
+ Chuyển gen nhờ virus
+ Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những
năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980
đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn). Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững hiệu quả chuyển gen cao; tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trông có
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự "nhiễu gen" và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây...
Đặc biệt là khi nhược điểm của A. tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây
hai lá mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới.
* Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu
chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium thì A. tumefaciens được sử dụng nhiều nhất
cho việc chuyển gen. Phân loại khoa học:
Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A. tumefaciens
Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử
dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi đó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một đoạn DNA từ vi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất như: nopaline, octopine gọi chung là opine. Các chất này không hề có
trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhận này có bản chất là vật chất di truyền.
Hình 1.7. Sơ đồ Ti-Plasmid
(Nguồn: http://www.wikipedia.org)
Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti- plasmid có trong vi khuẩn A.tumefaciens.
Đây là một plasmid được cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right
border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotide tương tự nhau. T-DNA
là đoạn nucleotide có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gen), mã hóa cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ 2 liên quan tới tổng hợp opine. Đoạn này được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể và gây ra bệnh u. Trên Ti-
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
plasmid còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hóa opine (Hình 1.7).
Khi cây bị nhiễm bênh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid.
* Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất phenol: acetosyringone và hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng Vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với genom cây chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumefaciens sang tế bào cây chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F (hình 1.8). Các gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hóa học acetosyringone (AS). Tín hiệu hóa học được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên cây. Protein vir A tự photphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được photphoryl hóa [37] và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H [53].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 1.8. Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật Tiếp đó các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng
giải phóng sợi T-DNA, protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5' của bờ phải và 3' của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây [31]. Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein vir C1, vir C2 có tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA.
Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA [53]. Như vậy thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
1.3.3. Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen 1.3.3.1. Những nghiên cứu trên thế giới 1.3.3.1. Những nghiên cứu trên thế giới
Dân số thế giới đã đạt đến con số kỷ lục 6 tỷ người và nó được dự đoán sẽ tăng lên 8 tỷ người vào năm 2025 và gấp đôi vào những năm 2050. Do vậy vấn đề cung cấp lương thực cũng như các nguyên vật liệu khác cho nhu cầu sinh hoạt của con người trong những thập niên tới là một thách thức rất lớn đối với toàn nhân loại. Các phương pháp chọn giống truyền thống sẽ khó có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp thực phẩm cho con người trong tương lai. Để đáp ứng được nhu cầu đó, trong những thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ biến đổi gen đã đem lại một bước nhảy vọt không những trong việc tăng năng suất và chất lượng cây trồng như tạo giống năng suất cao, chống bệnh sâu hại, chống chịu khí hậu lạnh, khô hạn và thiếu nguồn dinh dưỡng, kháng thuốc trừ cỏ…mà còn cải thiện được môi trường như giảm hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật, giảm lượng phân bón….
Vì mang lại những lợi ích ổn định và bền vững về kinh tế, môi trường, làm tăng sản lượng nông nghiệp, cải thiện đời sống của người nông dân, cây trồng biến đổi gen hay gọi là cây trồng CNSH ngày càng được trồng nhiều hơn trên toàn cầu. Tính đến hết năm 2009 diện tích trồng cây CNSH đã tăng lên 134 triệu ha, tăng 7% so với năm 2008. Diện tích trồng cây CNSH ở các nước đang phát triển tăng 13% vào năm 2009, so với 3% ở các nước công nghiệp. Trong tổng số 25 quốc gia trồng cây CNSH thì Hoa Kỳ là nước trồng cây này lớn nhất thế gới (64 triệu ha), tiếp theo là các nước như Barzil, Argentina, Ấn độ, Canada, Trung Quốc, Paraguay và Nam Phi [37]. Tại các quốc gia này, cây CNSH chủ yếu được sử dụng là cây ngô, đậu tương, và cây bông được chuyển gen kháng sâu (Bt). Từ những thành quả đem lại đã cho thấy sự tin cậy của hàng triệu nông dân trên thế giới đối với cây trồng CNSH. Một trong những thành quả mà cây trồng CNSH đem lại đó là tại Ấn Độ,
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
trong khoảng thời gian từ năm 2002 đến 2008, tổng lợi nhuận kinh tế mà cây bông biến đổi gen Bt mang lại là 5,1 tỷ USD. Hơn thế nữa, các giống bông Bt cũng làm giảm một nửa lượng thuốc trừ sâu cần sử dụng, và làm tăng gấp đôi thu hoạch, điều này chuyển Ấn Độ từ nước nhập khẩu bông thành nước xuất khẩu bông lớn nhất thế giới. Tại Phillipine, giống ngô biến đổi gen đã được trồng khảo nghiệm và sau đó được trồng rộng rãi, với diện tích trồng ngô biến đổi gen (kháng sâu đục thân châu Á) từ 10 769 ha (năm 2003) lên đến 81 652 ha (năm 2008).
Trong lĩnh vực Lâm nghiệp, cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu. Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu, và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi lê và Trung Quốc. Mục đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên quan đến tăng sinh khối, chống chịu sâu bệnh và điều kiện khô hạn, giảm hàm lượng lignin, tăng hàm lượng và độ dài sợi cellulose, mang lại lợi ích to lớn cho ngành công nghiệp giấy cũng như cải tạo môi trường tại những vùng đất suy thoái thiếu chất dinh dưỡng…
Hiện tại, số lượng các gen được xác định trình tự ở loài bạch đàn là rất ít, nếu so với Arabidopsis thaliana. Cho đến nay, mới chỉ có khoảng 4000 trình tự gen được tìm thấy ở loài bạch đàn (bao gồm cả trình tự của ribosome và lục lạp). Trong đó chủ yếu các gen được phân lập và xác định các đặc tính là các gen liên quan đến các đặc tính có giá trị kinh tế như các gen liên quan đến quá trình hình thành gỗ, quá trình nở hoa của cây, quá trình hấp thu dinh dưỡng cũng như tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, chống chịu sâu bệnh [46]. Xây dựng thư viện cDNA, EST và xác định biểu hiện của gen là công cụ cần thiết cho nghiên cứu các tính trạng quan trọng của cây. Sau khi gen cho tính trạng cần nghiên cứu đã được xác định, việc phân tích các biểu
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
hiện của gen trong quá trình sinh học phát triển là cần thiết làm tiền đề cho các nghiên cứu về thao tác di truyền và chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử.
Với cây rừng, xây dựng thư viện cDNA cho trình tự ESTs (sequencing for Express Sequence Tag) gần đây bắt đầu được nghiên cứu. Mehta và cộng sự 2005 đã bước đầu nghiên cứu thiết lập thư viện EST cho cây đước Ấn Độ để nghiên cứu mối tương quan giữa gen với tính chịu mặn. Jun-ichiro và cộng sự (1997) cũng đã lập thư viện cDNA cho các gen biểu hiện về sự phân hóa xylem trong quá trình hình thành độ kéo căng của gỗ bạch đàn camal. Năm 1998, Isabel allona và cộng sự cũng đã xây dựng thư viện cDNA và EST cũng như xác định một số gen và biểu hiện của nó trong quá trình hình thành gỗ của thông taeda (Pinus taeda). Một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin, cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài bạch đàn Eucalyptus globulus [46]; E. gunnii [40]; E. camaldulensis [37]; E. grandis [43]. Các gen liên quan đến tăng khả năng hấp thụ lân cũng đã được
phân lập từ bạch đàn trắng tại Nhật Bản, trong số 5 gen được phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và giàu lân [49]. Các gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulo đã được phân lập và nghiên cứu [43]. Bảy gen mã hóa sinh tổng hợp cellulo đã được phân lập từ bạch đàn grandis các gen này được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lượng cũng như độ dài sợi gỗ.
1.3.3.2. Những nghiên cứu trong nƣớc
Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học trong nông, lâm nghiệp phát triển mạnh mẽ tại Việt Nam. Công nghệ biến đổi gen cũng đã có những bước đi quan trọng trong quá trình phát triển khoa học công nghệ tại Việt Nam và được nhà nước quan tâm, đầu tư. Nhiều chương trình, dự án, đề tài nghiên cứu đã được triển khai. Một số đề tài nghiên cứu phân lập gen có ý nghĩa kinh tế và tạo cây trồng chuyển gen đã được phê duyệt trong những năm gần đây. Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu tạo cây chuyển gen đang
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
tập trung chủ yếu vào khâu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen thông qua việc chuyển các gen chỉ thị [21], [26]. Các phương pháp chuyển gen đã được sử dụng như Súng bắn gen, vi khuẩn Agrobacterium để biến nạp gen vào các cây trồng khác nhau là lúa, đậu xanh, hồng, thuốc lá, cải bắp [5], [21], [26], [27]. Một số tác giả đã tiến hành phân lập và xác định trình tự gen, thiết kế vector biểu hiện và nghiên cứu biểu hiện gen [3], [6], [14], [15]. Tuy nhiên hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung cho cây nông nghiệp như lúa (chuyển gen chịu hạn, chuyển gen có hàm lượng vitamin A cao), đậu tương (chuyển gen kháng sâu và kháng hạn), ngô (chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu), bông (chuyển gen kháng sâu và chịu hạn), đu đủ (chuyển gen kháng virus đốm vòng)...
Trong lĩnh vực lâm nghiệp, nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen vẫn còn là khá mới mẻ tại Việt Nam. Trong những năm cuối của thập niên 90, cây bạch đàn chuyển gen làm giảm hàm lượng lignin đã được trồng thử nghiệm đầu tiên ở Việt Nam do Viện khoa học lâm nghiệp phối hợp với công ty giấy Oji của Nhật thực hiện, tuy nhiên đây chỉ là nghiên cứu ban đầu và đánh giá tác động của cây biến đổi gen đến môi trường. Gần đây, trong khuôn khổ