Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó ngâm mẫu trong dung dịch 1/2 MS có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong 10 phút, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Thấm khô mẫu, chuyển lên môi trường nuôi cấy chọn lọc có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và chọn lọc để tái sinh chồi chuyển gen.
Môi trường chọn lọc và tái sinh có bổ sung kháng sinh cefotaxime với nồng độ là 500 mg/l và chất chọn lọc kanamycin ở nồng độ 50 mg/l để chọn lọc chồi chuyền gen. Sau 4 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển được chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin. Sau 4 tuần xác định số mẫu cấy tái sinh/ mẫu cấy ban đầu, số chồi tái sinh/ tổng số mẫu cấy ban đầu.
2.2.7. Phƣơng pháp tách chiết DNA ở thực vật 2.2.7.1. Pha hóa chất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Để ở 4oC cho đến khi sử dụng: Chỉ nên sử dụng trong 1 tháng
STT Hóa chất Nồng độ sử dụng Thể tích
1 Tris-HCl 1M pH = 8 100 mM 5 ml
2 EDTA 0,5M pH = 8 5 mM 0.5 ml
3 Sorbitol 0,35 M 3,1885 g
4 Na2HPO4 0,4% 0,5 g
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 50 ml
+ Đệm chiết: 25 ml
Trước khi sử dụng để trong bể 65o
C cho đệm chiết tan hoàn toàn, lấy thể tích cần dung, cho thêm β-mercapto ethanol 0,1% sau đó để lại bể 65oC đến khi sử dụng STT Hóa chất Nồng độ sử dụng Thể tích 1 CTAB 6% 1,5 g 2 NaCl 5M 1,4 M 7 ml 3 EDTA 0,5M pH = 8 20 mM 2 ml 4 Tris-HCl 1M pH = 8 100 mM 2,5 ml 5 β-mercapto ethanol 0,1% 25 µl
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml
2.2.7.2. Các bƣớc tiến hành
Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu bạch đàn theo phương pháp của Grattapaglia và Sederoff 1994 cụ thể bao gồm các bước sau: + Nghiền 0,2 g mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2ml. Thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút.
+ Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, sau đó ly tâm(12000 vòng/phút, 4oC, 12 phút), loại dịch nổi và lặp lại bước này từ 1-2 lần
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
+ Loại bỏ dịch nổi và bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng
+ Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút . Thêm 0,8 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).
+ Dùng pipet hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.
+ Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
+ Loại dịch nổi, rửa tủa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC, lặp lại bước này 2 lần. Sau đó nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi chỉ giữ lại tủa DNA.
+ Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không.
+ Bổ sung 50-100 µl nước deion có cho thêm RNAse. Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% và đo OD.
2.2.8. Phƣơng pháp điện di DNA Các bƣớc thực hiện:
+ Chuẩn bị khay và lược.
+ Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1g agarose, bổ sung xấp xỉ 100 ml TAE 1X. Đun agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất.
+ Để nguội khoảng 50 - 60oC.
+ Đổ dung dịch vào khay sao cho không có bọt khí.
+ Sau 1h rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di. Cho đệm TAE 1X ngập gel 2 mm. + Cho 5 µl loading dye vào mẫu, tra vào giếng, tra 1 kb ở giếng cuối cùng và điện di ở hiệu điện thế 90V, thời gian chạy điện di từ 2 giờ - 2 giờ 30 phút.
Sau khi điện di xong chúng ta sẽ tiến hành nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong 20 - 30 phút trong dung dịch EtBt 0,5 µg/ml, rửa lại bằng nước cất và quan sát dưới tia UV (254 nm) trên máy soi DNA, (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), ảnh được chụp bằng máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2.2.9. Kiểm tra sự có mặt cuả gen EcHB1 bằng kỹ thuật PCR
+ Tiến hành kiểm tra PCR xem sự có mặt của gen EcHB1 được biến nạp vào tế bào: các chồi sau khi cao khoảng 3 - 5 cm được cắt đưa vào môi trường ra rễ. Trong khoảng 2 - 4 tuần các chồi sẽ ra rễ là sự biểu hiện tạm thời của gen EcHB1 được biến nạp vào tế bào.
+ Kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân một đoạn gen EcHB1
có chiều dài 759bp. Trình tự cặp mồi:
EcHB1-F: 5’- CACCACGCGTGATATCATGTGCCCTATCGAT - 3’ EcHB1-R: 5’- GGGTCGACTTAACAAGCGGCTGAT - 3’
Chu kỳ nhiệt: - 940C trong 4 giây.
- 940C trong 1 phút, 550C trong 1 phút; 720C trong 1 phút lặp lại 30 chu kỳ. - 720C trong 7 phút, giữ sản phẩm ở 40C. Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR TT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O cất 2 lần deion 16 2 10X PCR buffer 2,5 3 dNTP 2,5 4 Taq polymerase 1 5 Mồi EcHB1-F 1 6 Mồi EcHB1-R 1 7 DNA khuôn 1 Tổng thể tích 25
DNA khuôn được tách chiết từ lá non của các dòng cây bạch đàn ra rễ trên môi trường chọn lọc.
2.3. Các công thức sử dụng trong xử lý số liệu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2000 lux, chu kỳ 16 giờ sáng, 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 26 ± 2oC. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng phần mềm Excel.
+ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = x 100%
+ Tỷ lệ mẫu sạch= x 100%
+ Tỷ lệ mẫu nẩy mầm = x 100%
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro
Đây là giai đoạn đầu tiên có vai trò quan trọng nhằm cung cấp cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống in vitro. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ phôi hạt nẩy mầm cao và tỷ lệ mẫu sạch cao. Để đáp ứng được như trên thì các mẫu phôi hạt lấy từ ngoài môi trường tự nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi trường nuôi cấy. Thông thường mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn.
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy với thời gian khử trùng khác nhau đã đem lại hiệu quả khác nhau về các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nẩy mầm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Bảng 3.1. Kết quả tạo mẫu bạch đàn sau 7 ngày nuôi cấy Hóa chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu cấy Mẫu nhiễm Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu sạch (%) Mẫu nẩy mầm Tỷ lệ nảy mầm (%) NaOCl 30 10 100 55 45 45 37 37 20 100 25 75 75 51 51 30 100 13 87 87 42 42
Dựa vào bảng kết quả cho thấy: khi sử dụng Javen 30% ở thời gian khử trùng tăng lên mẫu nhiễm giảm nhưng mẫu chết tăng lên. Cụ thể tương ứng với các thời gian khử trùng 10 phút, 20 phút, 30 phút có các tỷ lệ mẫu nhiễm là 55%, 25%, 10%, tỷ lệ mẫu sạch là 45%, 75%, 87%. Đồng thời khả năng nẩy mầm của phôi cũng chịu ảnh hưởng của thời gian khử trùng. Khi thời gian khử trùng tăng lên thì khả năng nẩy mầm của phôi giảm. Điều này do nước Javen tương tự như HClO, có tính oxi hóa rất sẽ gây ảnh hưởng lớn tới quá trình nảy mầm của hạt, nếu ngâm hạt trong nước javen trong thời gian dài.
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng với NaOCl 30% đến kết quả tạo mẫu Bạch đàn sạch in vitro từ phôi hạt.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Ở biểu đồ 3.1 cho thấy khử trùng băng Javel 30% với thời gian 10 phút thì tỷ lệ nhiễm cao và tỷ lệ nẩy mầm so với mẫu sạch cho thấy mẫu nẩy mầm cao nhưng mẫu nhiễm nhiều. Ở thời gian 20 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Ở thời gian 30 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhưng số mầm cây không nẩy cao.
Từ hiệu quả khử trùng của Javen 30% theo các mức thời gian như trên, ta thấy sử dụng Javen 30% ở thời gian 20 phút đem lại tỷ lệ mẫu sạch và nẩy mầm tốt nhất.
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
3.2.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng nhóm cytokinin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
Phôi hạt sau khi nuôi cấy 5 ngày trên môi trường MS phát triển thành cây mầm. Các lá mầm và thân mầm được cắt thành các mảnh nhỏ cấy lên các công thức môi trường tái sinh (CT1-12).
Sau 4 tuần nuôi cấy, tiến hành thu thập, đánh giá, xử lý số liệu và kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đến khả năng tái sinh
CTNC
Số mẫu
cấy
Số mẫu tái sinh trực tiếp (số mẫu/%)
Số chồi /mẫu
Số mẫu tái sinh từ mô sẹo (số mẫu/%) Số chồi /mẫu ĐC 96 0/0,00 0,00 0/0,00 0,00 CT1 112 15/13,39 1,33 20/17,86 1,33 CT2 125 19/15,20 1,67 27/21,60 1,33 CT3 120 17/14,17 2,00 24/20,00 1,67 CT4 128 18/14,06 1,33 19/14,84 1,67 CT5 112 19/16,96 1,67 20/17,86 1,67 CT6 112 17/15,18 2,00 19/16,96 2,33 CT7 112 21/18,75 3,33 23/20,54 3,67 CT8 128 30/23,44 4,00 31/24,22 3,67 CT9 112 20/17,85 3.33 27/24,11 3,33
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
CT10 128 21/16,41 4,00 30/23,44 3,67
CT11 128 22/17,19 4,33 31/24,22 4.00
CT12 112 19/16,96 3,33 25/22,32 3.67
Kết quả cho thấy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đã thể hiện rõ hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh trực tiếp từ môi sẹo. Ở công thức đối chứng (môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng), 100% các mảnh cấy không có khả năng tạo mô sẹo, còn trên các công thức môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh trực tiếp từ mô sẹo khác nhau. Ở các công thức thí nghiệm với cùng một loại chất điều hòa sinh trưởng nhưng có nồng độ khác nhau và tỷ lệ các chất khác nhau cũng cho kết quả tái sinh trực tiếp và tái sinh từ mô sẹo.
Biều đồ 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Khi sử dụng môi trường bổ sung BAP đơn lẻ ở nồng độ 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,8 mg/l tương ứng với các công thức CT1, CT2, CT3 cho thấy ở công thức CT2 tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 15,20% ở tái sinh trực tiếp và 21,60% ở tái sinh từ mô sẹo (biểu đồ 3.2). Mặt khác,theo quan sát thấy sự hình thành chồi và chất lượng chồi kém nên trung bình số chồi/mẫu ở môi trường có bổ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
sung BAP đơn lẻ rất thấp, cao nhất là 2,00 số chồi/mẫu với tái sinh trực tiếp và 1,67 số chồi/mẫu với tái sinh từ mô sẹo (bảng 3.2).
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Khi sử dụng Kinetin đơn lẻ trên môi trường ở các nồng độ 0,3mg/l; 0,5 mg/l; 0,8 mg/l tương ứng với các công thức CT4, CT5, CT6 cho thấy ở môi trường CT5 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất là 16,96% ở tái sinh chồi trực tiếp và 17,86% ở tái sinh chồi từ mô sẹo (biểu đồ 3.3). Cũng như đối với môi trường BAP đơn lẻ, sự hình thành chồi và chất lượng chồi kém nên trung bình số chồi/mẫu cao nhất là 2,00 ở tái sinh trực tiếp và 2,33 ở tái sinh từ mô sẹo (bảng 3.2).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Nghiên cứu ảnh hưởng khi kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và Kinetin kết quả cho thấy, tỷ lệ tái sinh chồi tăng lên và số chồi trên mành cấy cũng tăng, đa số chồi có chất lượng tốt, cao và đồng đều. Ở công thức môi trường CT8 có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l Kinetin cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (23,44% ở tái sinh chồi trực tiếp và 24,22% ở tái sinh từ mô sẹo) và số chồi/mẫu cao (4.00 chồi/mẫu ở tái sinh trực tiếp và 3,67 chồi/mẫu ở tái sinh tử mô sẹo). Vậy ta chọn công thức môi trường CT8 khi kết hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và Kinetin cho tái sinh chồi (biểu đồ 3.4).
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của BAP và TDZ đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp Khi sử dụng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và TDZ , hiệu quả tái sinh chồi cao hơn so với sử dụng đơn lẻ BAP nhưng thấp hơn so với tổ hợp BAP + Kinetin. Ở công thức môi trường bổ sung 0,3 mg/l BAP + 0,3 mg/l TDZ có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 17,19% ở tái sinh trực tiếp; 24,22% ở tái sinh từ mô sẹo và 4,33 chồi/mẫu ở tái sinh trực tiếp và 4,00 chồi/mẫu ở tái sinh từ mô sẹo (biểu đồ 3.5) (bảng 3.2).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Hình 3.1. Thân mầm tái sinh chồi sau 5 tuần nuôi cấy
Như vậy trong môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin, thì công thức môi trường CT8 (MS + 0,3 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar) là môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi.
Thực tế khi nghiên cứu cho thấy, sau khoảng 5 - 7 tuần nuôi cấy trong môi trường tái sinh bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin các chồi phát triển chậm lại, thân ngắn ảnh hưởng tới ra cây sau này.
3.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trƣởng nhóm auxin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo
Các lá mầm và thân mầm sau khi cắt thành những mảnh nhỏ được cấy