Agrobacterium tumefaciens
3.3.1. Tạo dịch huyền phù
Lấy khuẩn lạc A. tumefaciens chủng CV58/pGWB2 mang gen EcHB1
được nuôi phục hồi để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen. Dịch huyền phù vi khuẩn thu được có giá trị đo OD600 = 0,5 đủ điều kiện biến nạp vào thân và lá mầm bạch đàn
3.3.2. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Thân mầm và lá mầm bạch đàn được cho vào dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30 phút, sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng. Các mảnh thân và lá được đồng nuôi cấy trong tối trong các khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trên môi trường: MS (1/2 N) + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 200 µM AS. Sau khoảng thời gian này mẫu được cấy chuyển lên môi trườn tái sinh mới bổ sung 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycin. Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, thu thập số liệu và xử lý kết quả trình bày như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp Công thức Thời gian đồng
nuôi cấy(giờ) Sô mẫu thí nghiệm Số mẫu tái sinh Tỷ lệ (%) Đ1 24 60 2 3 (2/60) Đ2 48 60 6 10 (6/60)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Đ3 72 60 0 0
Số lượng chồi của kết quả chỉ đánh giá tạm thời đến hiệu quả biến nạp. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với các mẫu ở thời gian đồng nuôi cấy 48 giờ (Đ2) cho tỷ lệ chồi sau khi biến nạp cao nhất (10%). Ta nhận thấy rằng ở thời gian 72 giờ đồng nuôi cấy thì tỷ lệ mẫu bị úng nhũn và nhiễm lại cao, khó diệt khuẩn và tỷ lệ mẫu chết khá cao (bảng 3.6).
3.3.3. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen
Căn cứ vào kết quả thu được từ các thí nghiệm ở phần trên, các mẫu sau khi đồng nuôi cấy được mang đi diệt khuẩn và cho vào môi trường tái sinh có bổ sung kanamicyn và cefotaxim: MS(1/2 N) + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IBA + 50 mg/l kanamicyn + 500 mg/l cefotaxime. Sau 4 tuần nuôi cấy ở môi trường tái sinh thu được kết quả trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hiệu suất chuyển gen trong thí nghiệm Loại vật liệu nhận gen Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tái sinh chồi Số chồi dương tính trên môi trường chọn lọc Số chồi dương tính với PCR Tỷ lệ (%) chôi dương tinh/ chôi tái sinh Tỷ lệ (%) cây chuyển gen/∑ mẫu thí nghiệm Mảnh lá mầm 508 45 3 3 6,67 (3/45) 0.59 (3/508) Đoạn thân mầm 513 42 5 4 9,52 (4/42) 0,78 (4/513) Tổng 1021 87 8 7 8,04 (7/87) 0,69 (7/1021)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Các mẫu sau khi cho vào môi trường chọn lọc có kanamycyn và cefotaxim để diệt khuẩn, ta quan sát thấy có rất ít lượng mẫu tái sinh thành chồi, các mẫu còn lại phân hóa chậm, vàng dần, đen và chết. Như vậy có thể ở những mẫu phân hóa chậm, vàng dần, đen và chết là do các gen kháng Kan được chuyển vào nhưng không tiếp tục phiên mã hoặc chúng chưa được chuyển vào nên không tái sinh được trên môi trường chọn lọc. Các mẫu tái sinh thành chồi được đưa sang môi trường chọn lọc mới để tránh các mẫu chết sản sinh ra các chất làm ức chế tái sinh ở các mẫu ra chồi.
Hình 3.4. Kết quả tái sinh và ra rễ. i: lá mầm tái sinh trên môi trường chọn lọc; ii: thân mầm tái sinh trên môi trường chọn lọc; iii: Các chồi sau 32 tuần
nuôi cấy; iv: chồi ra rễ trong môi trường chọn lọc
Các mẫu tái sinh chồi sau khi chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung chất chọn lọc cho thấy rất ít chồi ra rễ, sinh trưởng chậm hoặc ngừng sinh trưởng. Các chồi ra rễ được lấy các mảnh lá đem tiến hành PCR kiểm tra đánh
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
giá tạm thời sự có mặt của gen. Từ kết quả cho thấy, thân mầm có tỷ lệ chồi chuyển gen/∑ chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc cao hơn so với mảnh lá mầm và tỷ lệ 0,78% cây chuyển gen/∑ mẫu thí nghiệm cao nhất trong các công thức nghiên cứu.
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sảm phẩm. i: Kết quả kiểm tra DNA tổng số của bạch đàn; ii: Kết quả điện di PCR nhân gen (M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: đối
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Nghiên cứu và tìm được môi trường và các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp với khả năng tái sinh trực tiếp và tái sinh từ mô sẹo: + Xác định được chất điều hòa trưởng thích hợp cho tái sinh ở bạch đàn là 0,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l IBA thu được: i) tỷ lệ tái sinh chồi trực tiếp đạt cao nhất là 39,29%, trung bình 4,67 chồi/mẫu; ii) tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo đạt cao nhất là 40,62%, trung bình 4,33 chồi/mẫu.
+ Xác định được môi trường ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo có tỷ lệ tạo tái sinh chồi đạt 97,78% trên môi trường MS*.
1.2. Xác định được khả năng ra rễ có tỷ lệ ra rễ đạt 100% trên môi trường bổ sung 0,6 mg/l NAA và 0,2 mg/l IBA.
1.3. Xây dựng được quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) thông qua Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen đạt 0,78% cây chuyển gen/tổng số
mẫu thí nghiệm và đã thu được bạch đàn urô mang gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2. KIẾN NGHỊ
2.1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật vi nhân giống bạch đàn urô để ứng dụng vào sản xuất cây trồng chất lượng tốt phục vụ trồng rừng sản xuất. 2.2. Đưa dòng bạch đàn urô chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) ra ngoài điều kiện tự nhiên. Theo dõi sinh trưởng và phát triển của bach đàn, thu hạt kiểm tra mức độ ổn định của gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
2.3. Ứng dụng nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào các đối tượng cây lâm nghiệp có ý nghĩa kinh tế khác.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Andrew I. (1991), Thiết kế đơn giản cho các thí nghiệm lâm nghiệp , Bản tin, Viện nghiên cứu lâm nghiệp (số 71), 39 trang.
2. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2002), Số liệu thống kê về Nông nghiệp và
PTNT 1996 – 2001, Hà Nội, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 599 trang.
3. Bùi Văn Thắng, Chu Hoàng Hà, Hoàng Xuân Xính, Nguyễn Văn Mùi, Lê Trần bình (2005), "Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ glycoprotein của virus dại. Báo cáo Khoa học", Hội nghị Khoa học
toàn quốc về Công nghệ Sinh học, hướng 8.2, tr. 306-308.
4. Dương Mộng Hùng (1993), Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho hai loài bạch đàn E. camadulensis và E. urophylla, Báo
cáo đề tài, trường Đại Học Lâm nghiệp, Hà Tây.
5. Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001a), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào một số giống cải bắp (Brassica oleraceavar capitana) qua
Agrobacterium", Kết quả nghiên cứu khoa học 1999-2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà nội, tr. 120-128.
6. Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001b), "Phân lập và thiết kế vector mang gen tổng hợp insulin để chuyển vào cây lúa mì", Thông tin Công nghệ Sinh học ứng dụng, tr. 36-41.
7. Lê Châu Thanh, Phạm Thanh Thoại, Doãn Thái Hòa, Những bài thí nghiệm về hóa học gỗ và cenlulose, NXB ĐH Bách Khoa Hà Nội.
8. Lê Đình Khá (1970), Một dạng Bạch đàn mới sinh trưởng nhanh ở miên Bắc Việt Nam, Tập san lâm nghiệp, (số 3), 6 trang.
9. Lê Đình Khá (1999), Nghiên cứu sử dụng giống lại tự nhiên giữa Keo
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
10. Lê Đình Khá và Nguyễn Việt Cường (2001), Ưu thế lai về sinh trưởng và tính chống chịu của một số tổ hợp lai khác loài ở Bạch đàn, NXB
Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 41-43.
11. Lê Đình Khá, Đoàn Thị Mai (2002), "Một số phương thức nhân
giống sinh dưỡng trong sản xuất lâm nghiêp", Công nghệ nhân và sản xuất
giống cây trồng, giống cây lâm nghiệp và giống vật nuôi, NXB Lao Động xã hội (Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hưng Quốc), Hà Nội (2002), tr. 166-182.
12. Lê Đình Khá và cộng sự (2003), Chọn tạo và nhân giống cho một số
loài cây trông rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội..
13. Lê Đình Khá, Dương Mộng Hùng (2003), Giống cây rừng, NXB
Nông nghiệp, Hà Nội.
14. Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thuỳ Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2004a), "Thiết kế vector thế hệ mới mang gen kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào cây trồng", Tạp chí Công
nghệ Sinh học, 2(1),tr. 85-92.
15. Lê Thị Thu Hiền, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Hải Yến, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2005), "Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp thế hệ mới mang gen mã hoá vip3A có hoạt tính diệt côn trùng", Hội nghị khoa học toàn quốc 2005: Công nghệ Sinh học trong nghiên cứu cơ bản. Trường Đại Học Nông nghiệp I Hà nội.
16. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
17. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1998), "Bước đầu chuyển gen bar, gen gus và gen cryIA(c) vào cây đậu xanh (Vigna radiata L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens", Hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về Công nghệ Sinh học cây lúa, 86-87.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
18. Nguyễn Đức Kiên, Trần Hồ Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David Clapham, Sara von Arnold (2009), "Cellulose content as a selection trait in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla", Ann. For. Sci.
(66), tr. 711-719.
19. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalytus theo sinh trưởng và kháng bệnh ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
20. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khá, Hoàng Chương (1993), Kết quả
khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa
học, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam, 41 trang.
21. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ
basta bằng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo
cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội, tr. 1297-1304.
22. Nguyễn Luyện, "Tìm hiểu về cây bạch đàn E. urophylla", Tạp chí lâm nghiệp (số 10, tháng 10/1991).
23. Nguyễn Quang Thạch, (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB
Nông nghiệp Hà Nội.
24. Nguyễn Quang Thạch, (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB
Nông nghiệp, Hà Nội.
25. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
26. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia forturey) và ảnh hưởng
của tác nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, tr. 866-869.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
27. Phan Tố Phượng, Phạm Thu Hằng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Lili C., Zhang S., Fauquet C. M., Beachy R. N. (1998). Chuyển gen kháng hygromycin, gen gus và gen kháng bệnh bạc lá vào lúa bằng súng bắn gen. Tạp chí Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, (2), tr. 56-57.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
28. Anterola M., Lewis G. (2002), "Trends in lignin modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic manipulations/mutations on lignification and vascular integrity", Phytochemistry 6, pp 221–294.
29. Baghdady A., Blervacq A.S., Jouanin L., Grima-Pettenati J., Sivadon P., Hawkins S. (2006), "Eucalytus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in lignifying cell during primary and secondary xylem formation in Arbidopsis thaliana", Plant Physiol and Bioch 44, pp. 674-683.
30. Demura, T., Tashiro, G., Horiguchi, G., Kishimoto, N., Kubo, M., Matsuoka, N., Minami, A., Nagata-Hiwatashi, M., Nakamura, K., Okamura, Y., Sassa, N., Suzuki, S., Yazaki, J., Kikuchi, S., and Fukuda, H. (2002), “Visualization by comprehensive microarray analysis of gene expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into xylem cells”,
PNAS USA 99, pp. 15794-15799.
31. Demura T., Ye Z.-H. (2010), “Regulation of Plant Biomass Production”, Current Opin Plant Biol, in press.
32. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin, Volume 4, number 4. 33. Endo, S., Pesquet, E., Yamaguchi, M., Tashiro, G., Sato, M., Toyooka, K., Nishikubo, N., Udagawa-Motose, M., Kubo, M., Fukuda, H., and Demura, T. (2009), "Identifying new components participating in the secondary cell wall formation of vessel elements in zinnia and Arabidopsis",
Plant Cell, 21, pp. 1155-1165.
34. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J. (1995), "Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants", Plant Mol Biol, 4(27),
pp. 651-667.
35. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003), "Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco", Plant Growth Regul, 41, pp. 279-286.
36. Ho, C., Y. Chen & Z. Chen (2002), "cDNA cloning and sequence analysis of 5 hydroxyconiferaldehyde -methyltransferese from Eucalyptus camaldulensis", Taiwan J. For. Sci, 17(4), pp. 429-438.
37. James Clive (2009), Global stutus of commercialzed biotech/GM crops: 2009, ISAAA brief No.41.
38. Jyayu B., Jianmin X. and Siming G. (2003), "Genetic improvement of Tropical Eucalypts in China. In Eucalyptus in Asia" Proceeding of an international conference. Turbull J.E. edit, pp. 64-70.
39. Kubo M., Udagawa M., Nishikubo N., Horiguchi G., Yamaguchi M., Ito J., Mimura T., Fukuda H., and Demura T. (2005), "Transcription switches between protoxylem and metaxylem vessel formation", Genes Dev, 19, pp.
1855-1860
40. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J. (2002), "The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species", Plant Mol Biol, 50(3), pp. 497-509.
41. Lauvergeat, V., P. Rech, A. Jauneau, C. Guez, P. Coutos-Thevenot & J. Grima-Pettenati (2002), "The vascular expression pattern directed by the
Eucalyptus gunni cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is
conserved among woody and herbaceous plant species", Plant Mol Biol, 50(3), pp. 497-509.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
42. Luo Jianzhong (2003), "Variation in growth and wood density of Eucalyptus urophylla. In Eucalyptus in Asia", Proceeding of an international
conference. Turbull J.E. edit, pp. 94-100.
43. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M. Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danounl, Claie Halpin, Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudetl (2001), "Strong decrease in lignin content without significant alterration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobaco plants", The Plant Journal (2001), 28(3), pp. 257-270.
44. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A resied medium for rapid growth and bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol. Plant, (15), pp.
473-495.
45. Poke F.S, Rene E.Vaillancourt, Brad M.Potts & James B.Reid (2005), "Genomic research in Eucalyptus", Genetica (2005) 125, pp. 79–101.
46. Poke, F.S., R.E. Vaillancourt, R.C. Elliott & J.B. Reid (2003), "Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2)", Mol. Breed, 12(2), pp. 107-118.
47. Santos, P.E.T (1990), "Potential for genetic improvement program, estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in
Eucalyptus urophylla S.T.Blake stands", Scienctia Forestalis 43-44, pp. 11-19.
48. Sonoda, T., Koita, H., Nakamoto-Ohta, S., Kondo, K., Suezaki, T., Kato, T., Ishizaki, Y., Nagai,N., Iida, N., Sato, S., Umezawa, T., and Hibino, T. (2009), "Increasing fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor", Plant Biotech, 26, pp. 115-120.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
49. Takayoshi Koyama, Naoki Kato, Takashi Hibino, Tetsu Kawazu, Tetsuya Kimura*,Kazuo Sakka (2006), "Isolation and expression analysis of phosphate transporter genes from Eucalyptus camaldulensis", Plant Biotech, 23, pp. 215-218.
50. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), "Cinnamoyl-CoA reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in