+ Thu mẫu và xử lý mẫu: mẫu sau khi thu về, quả được phơi khô, sau vài ngày thì tách ra lấy hạt. Cho hạt vào bình thủy tinh rửa sạch bằng cách lắc mạnh với nước xà phòng loãng trong 20 phút, sau đó loại bỏ mày bám trên hạt và rửa hạt lại bằng nước máy nhiều lần. Hạt sau khi rửa lại bằng nước nhiều lần được sấy khô hoặc tiến hành vào mẫu ngay lúc đó.
+ Hạt bạch đàn được khử trùng theo công thức:
- Hạt bạch đàn được sát khuẩn bằng cồn 70% trong thời gian 1 phút, loại bỏ cồn, rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó khử trùng tiếp bằng Javel 30% trong thời gian 10 - 30 phút loại bỏ Javen, rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần.
Hạt bạch đàn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung thêm 30 g/l đường và 8 g/l agar, pH 5,8. Để trong tối, điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy 25o
C, trong thời gian 5 ngày. Sau 5 ngày trong tối, hạt bắt đầu nảy mầm và chuyển cây mầm nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2.500 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng nhóm cytokinin đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo
Thân và lá mầm được cắt thành những mảnh nhỏ, đặt ngay lên môi trường nuôi cấy (CT1-12) với các thành phần môi trường: MS + BAP + kinetin +TDZ + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8. Trong đó nồng độ BAP, kinetin và TDZ được thay đổi theo bảng 2.1. Sau 4 - 6 tuần thu thập số liệu và xử lý kết quả.
Bảng 2.1. Nồng độ BAP, kinetin và TDZ trong các công thức môi trường tái sinh Công thức nuôi
cấy
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)
BAP Kinetin TDZ ĐC 0 0 0 CT1 0,3 - - CT2 0,5 - - CT3 0,8 - - CT4 - 0,3 - CT5 - 0,5 - CT6 - 0,8 - CT7 0,3 0,3 - CT8 0,5 0,3 - CT9 0,3 0,5 - CT10 0,5 0,5 - CT11 0,3 - 0,3 CT12 0,3 - 0,5
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2.2.2.2. Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trƣởng nhóm auxin đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo
Thân mầm và lá mầm được cắt thành những mảnh nhỏ, đặt ngay lên môi trường nuôi cấy (C0-10) với các thành phần môi trường: MS + BAP + NAA + IBA +30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8. Trong đó, nồng độ BAP, NAA và IBA được thay đổi theo bảng 2.2. Sau 4 - 6 tuần thu thập số liệu và xử lý kết quả.
Bảng 2.2. Nồng độ BAP, NAA và IBA trong các công thức môi trường tái sinh Công thức nuôi
cấy
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) BAP (mg/l) NAA (mg/l) IBA (mg/l) C0 0 0 0 C1 0,3 0,1 - C2 0,5 0,1 - C3 0,8 0,1 - C4 0,3 0,2 - C5 0,3 0,3 - C6 0,3 - 0,2 C7 0,5 - 0,2 C8 0,8 - 0,2 C9 0,5 0,2 0,5 C10 0,5 0,3 0,3 C11 0,5 0,3 0,5
2.2.2.3. Ảnh hƣởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ của chồi
Các chồi bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có chiều cao từ 3 - 5 cm được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ, với công thức môi trường: MS + 30
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
g/l sucrose + 8 g/l agar + 0,2 mg/l IBA + NAA, pH = 5,8 . Trong đó, nồng độ NAA được thay đổi như bảng 2.3.
Chồi được nuôi dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2.500 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày, nhiệt độ phòng cấy 25 ± 2oC. Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ chồi ra rễ.
Bảng 2.3. Nồng độ NAA và IBA trong công thức môi trường ra rễ Công thức môi trường NAA (mg/l) IBA (mg/l) Số chồi cấy Số chồi ra rễ Tỷ lệ (%) ĐC 0 0,2 20 4 20 R1 0,3 0,2 20 9 45 R2 0,5 0,2 20 20 100 R3 0,8 0,2 20 15 75 R4 1 0,2 20 14 70
2.2.2.4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo mô sẹo
Thân mầm và lá mầm bạch đàn 7 ngày tuổi được cắt thành những mảnh nhỏ, lá có kích thước 1,5 x 1,5 mm và thân được cắt có chiều dài từ 0.7 – 1 cm được đặt ngay lên các môi trường dinh dưỡng (M1-5) với pH 5,8 lần lượt với các thành phần môi trường là:
MS + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar
1/2MS (môi trường MS giảm 1/2 các thành phần) + 30 g/l sucrose +8 g/l agar + chất điều hòa sinh trưởng
MS*(môi trường MS giảm 1/2 Nitơ) + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + chất điều hòa sinh trưởng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Knops* (môi trường Knops giảm 1/2 Nitơ) + điều hòa sinh trưởng Mẫu được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2.500 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 ± 2oC. Sau 4 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm.
2.2.3. Tạo vật liệu trƣớc khi chuyển gen
Lá mầm được cắt thành mảnh nhỏ có kích thước khoảng 1,5 x 1,5 mm, và thân mầm được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài từ 0,5 – 1 cm. Mẫu sau khi cắt được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi ở các khoảng thời gian: cảm ứng 0 giờ và 48 giờ trước khi đồng nuôi cấy.
2.2.4. Tạo dịch huyền phù
+ Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: lấy khuẩn A. tumefaciens chủng
CV58/pGWB2/EcHB1 được bảo quản trong glycerol ở -85o, cấy trải khuẩn trên môi trường LB đặc bổ sung 50 mg/l kanamycin. Nuôi khuẩn ở nhiệt độ 28oC trong 2 ngày.
+ Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc cho vào 10 ml môi trường LB lỏng bổ sung 50 mg/l kanamycin. Nuôi lắc 200 v/p, ở điều kiện nhiệt độ 28oC trong vòng 14 - 16 giờ. Sau đó hút 5 ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng. Nuôi lắc 200 v/p, ở nhiệt độ 28oC, trong 4 - 5 giờ. Đo nồng độ vi khuẩn với OD600 0,5 - 0,8 đủ điều kiện biến nạp. Dịch vi khuẩn được ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000 v/p, trong 10 phút loại bỏ dịch nổi, thu cặn vi khuẩn. Hòa tan cặn vi khuẩn trong dung dịch 1/2 MS lỏng để thu dịch huyền phù vi khuẩn đảm bảo OD600 0,5 - 0,8.
Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens
Môi trƣờng Thành phần
LB đặc 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l Tryptone + 16 g/l Bactor agar, pH = 7
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
LB lỏng 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10g/l Tryptone, pH = 7
Dịch lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Môi trường cơ bản 1/2 MS không bổ sung agar
2.2.5. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Mẫu sau khi xử lý, chuẩn bị cho biến nạp như mục 2.2.4 được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30 phút. Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng. Chuyển mẫu sang môi trường nuôi cấy cộng sinh (thành phần môi trường phụ thuộc vào thí nghiệm tái sinh trên). Môi trường nuôi cộng sinh được bổ sung thêm AS với nồng độ 200 µM. Nuôi cấy cộng sinh ở nhiệt độ 25oC, được nuôi trong buồng tối các khoảng thời gian là 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.
2.2.6. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen
Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó ngâm mẫu trong dung dịch 1/2 MS có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong 10 phút, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Thấm khô mẫu, chuyển lên môi trường nuôi cấy chọn lọc có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và chọn lọc để tái sinh chồi chuyển gen.
Môi trường chọn lọc và tái sinh có bổ sung kháng sinh cefotaxime với nồng độ là 500 mg/l và chất chọn lọc kanamycin ở nồng độ 50 mg/l để chọn lọc chồi chuyền gen. Sau 4 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển được chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin. Sau 4 tuần xác định số mẫu cấy tái sinh/ mẫu cấy ban đầu, số chồi tái sinh/ tổng số mẫu cấy ban đầu.
2.2.7. Phƣơng pháp tách chiết DNA ở thực vật 2.2.7.1. Pha hóa chất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Để ở 4oC cho đến khi sử dụng: Chỉ nên sử dụng trong 1 tháng
STT Hóa chất Nồng độ sử dụng Thể tích
1 Tris-HCl 1M pH = 8 100 mM 5 ml
2 EDTA 0,5M pH = 8 5 mM 0.5 ml
3 Sorbitol 0,35 M 3,1885 g
4 Na2HPO4 0,4% 0,5 g
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 50 ml
+ Đệm chiết: 25 ml
Trước khi sử dụng để trong bể 65o
C cho đệm chiết tan hoàn toàn, lấy thể tích cần dung, cho thêm β-mercapto ethanol 0,1% sau đó để lại bể 65oC đến khi sử dụng STT Hóa chất Nồng độ sử dụng Thể tích 1 CTAB 6% 1,5 g 2 NaCl 5M 1,4 M 7 ml 3 EDTA 0,5M pH = 8 20 mM 2 ml 4 Tris-HCl 1M pH = 8 100 mM 2,5 ml 5 β-mercapto ethanol 0,1% 25 µl
Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml
2.2.7.2. Các bƣớc tiến hành
Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu bạch đàn theo phương pháp của Grattapaglia và Sederoff 1994 cụ thể bao gồm các bước sau: + Nghiền 0,2 g mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2ml. Thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút.
+ Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, sau đó ly tâm(12000 vòng/phút, 4oC, 12 phút), loại dịch nổi và lặp lại bước này từ 1-2 lần
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
+ Loại bỏ dịch nổi và bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng
+ Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút . Thêm 0,8 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).
+ Dùng pipet hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 2 ml mới. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.
+ Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
+ Loại dịch nổi, rửa tủa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC, lặp lại bước này 2 lần. Sau đó nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi chỉ giữ lại tủa DNA.
+ Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không.
+ Bổ sung 50-100 µl nước deion có cho thêm RNAse. Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 1% và đo OD.
2.2.8. Phƣơng pháp điện di DNA Các bƣớc thực hiện:
+ Chuẩn bị khay và lược.
+ Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1g agarose, bổ sung xấp xỉ 100 ml TAE 1X. Đun agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất.
+ Để nguội khoảng 50 - 60oC.
+ Đổ dung dịch vào khay sao cho không có bọt khí.
+ Sau 1h rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di. Cho đệm TAE 1X ngập gel 2 mm. + Cho 5 µl loading dye vào mẫu, tra vào giếng, tra 1 kb ở giếng cuối cùng và điện di ở hiệu điện thế 90V, thời gian chạy điện di từ 2 giờ - 2 giờ 30 phút.
Sau khi điện di xong chúng ta sẽ tiến hành nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong 20 - 30 phút trong dung dịch EtBt 0,5 µg/ml, rửa lại bằng nước cất và quan sát dưới tia UV (254 nm) trên máy soi DNA, (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), ảnh được chụp bằng máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2.2.9. Kiểm tra sự có mặt cuả gen EcHB1 bằng kỹ thuật PCR
+ Tiến hành kiểm tra PCR xem sự có mặt của gen EcHB1 được biến nạp vào tế bào: các chồi sau khi cao khoảng 3 - 5 cm được cắt đưa vào môi trường ra rễ. Trong khoảng 2 - 4 tuần các chồi sẽ ra rễ là sự biểu hiện tạm thời của gen EcHB1 được biến nạp vào tế bào.
+ Kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân một đoạn gen EcHB1
có chiều dài 759bp. Trình tự cặp mồi:
EcHB1-F: 5’- CACCACGCGTGATATCATGTGCCCTATCGAT - 3’ EcHB1-R: 5’- GGGTCGACTTAACAAGCGGCTGAT - 3’
Chu kỳ nhiệt: - 940C trong 4 giây.
- 940C trong 1 phút, 550C trong 1 phút; 720C trong 1 phút lặp lại 30 chu kỳ. - 720C trong 7 phút, giữ sản phẩm ở 40C. Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR TT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O cất 2 lần deion 16 2 10X PCR buffer 2,5 3 dNTP 2,5 4 Taq polymerase 1 5 Mồi EcHB1-F 1 6 Mồi EcHB1-R 1 7 DNA khuôn 1 Tổng thể tích 25
DNA khuôn được tách chiết từ lá non của các dòng cây bạch đàn ra rễ trên môi trường chọn lọc.
2.3. Các công thức sử dụng trong xử lý số liệu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
2000 lux, chu kỳ 16 giờ sáng, 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 26 ± 2oC. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng phần mềm Excel.
+ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = x 100%
+ Tỷ lệ mẫu sạch= x 100%
+ Tỷ lệ mẫu nẩy mầm = x 100%
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro
Đây là giai đoạn đầu tiên có vai trò quan trọng nhằm cung cấp cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống in vitro. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ phôi hạt nẩy mầm cao và tỷ lệ mẫu sạch cao. Để đáp ứng được như trên thì các mẫu phôi hạt lấy từ ngoài môi trường tự nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi trường nuôi cấy. Thông thường mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn.
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy với thời gian khử trùng khác nhau đã đem lại hiệu quả khác nhau về các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu nẩy mầm.