Các mẫu đất thu về đƣợc xử lý và tiến hành phân lập trên môi trƣờng đặc hiệu có thành phần Ca3(PO4)2 trong môi trƣờng. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vòng trong bao quanh. Đây chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Ca3(PO4)2 có trong môi trƣờng phân lập chính là chất chỉ thị để phát hiện vi sinh vật có khả năng phân hủy phốtpho vô cơ. Xung quanh những khuẩn lạc đó sẽ xuất hiện vòng phân hủy tại đây Ca3(PO4)2 đã bị chuyển thành Ca(H2PO4)2 hòa tan trong nƣớc làm môi trƣờng trong hơn những phần khác. Kết quả phân lập đƣợc trình bày ở bảng 12:
Hình 3: Phân lập các chủng vi khuẩn phân giải lân
Từ 15 mẫu đất đã phân lập đƣợc 21 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân. Với mục đích tuyển chọn đƣợc những chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân cao và ổn định, từ 21 chủng vi khuẩn phân lập ở trên đƣợc cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
truyền nhiều lần. Sau 5 lần cấy truyền liên tục, từ 21 chủng vi khuẩn phân giải lân ban đầu đã chọn đƣợc 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính tƣơng đối ổn định. Hoạt tính phân giải các hợp chất phốtpho vô cơ khó tan thƣờng bị mất đi sau các lần cấy truyền. Điều này có thể là do các chủng phân lập đƣợc không thích ứng với điều kiện nhân tạo.
15 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân tƣơng đối ổn định trên đã đƣợc kiểm tra tiếp về hoạt tính bằng cách căn cứ vào đƣờng kính vòng phân giải (độ rộng vòng trong) đo đƣợc khi cấy lên môi trƣờng thạch bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch. 15 chủng vi khuẩn đƣợc cấy lên môi trƣờng trên đĩa pettri và ủ ở 300C. Sau 2 ngày đo đƣờng kính vòng trong xung quanh khuẩn lạc. Kết quả đƣợc trình bày tại bảng 12.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 12. Hoạt tính phân giải lân của 15 chủng mới phân lập
STT Ký hiệu chủng Hoạt tính phân giải lân (D-d, mm)
1 BL1 5 2 BL2 18 3 BL3 7 4 BL4 17 5 BL5 8 6 BL6 9 7 BL7 16 8 BL8 6 9 BL9 10 10 BL10 8 11 BL11 11 12 BL12 10 13 BL13 7 14 BL14 8 15 BL15 17
Số liệu bảng 12 cho thấy, chỉ có 4 chủng là BL2, BL4, BL7, BL15 (trong tổng số 15chủng phân lập) có hoạt tính phân giải lân với đƣờng kính vòng trong ≥ 16 mm, 12 chủng còn lại chỉ có đƣờng kính vòng trong < 11 mm.
Cả 4 chủng BL2, BL4, BL7, BL15 đều đƣợc thử hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 trong môi trƣờng dịch thể thông qua xác định hàm lƣợng P2O5 hòa tan sau 1 tuần nuôi cấy. Từ mật độ quang học (OD) đo đƣợc của 3 mẫu lƣợng P2O5 hòa tan đối với mỗi chủng (với mức ý nghĩa α = 0,01) trình bày trong bảng 13.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 13. Hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 trong môi trường dịch của các chủng vi sinh vật trong nhóm phân giải lân cao
STT Kí hiệu chủng Chỉ số OD Hàm lƣợng lân tan (µg/l)
1 BL2 0,050 17
2 BL4 0,203 20
3 BL7 0,156 15
4 BL15 0,046 4
Kết quả bảng 13 cho thấy, khả năng hòa tan P2O5 trong môi trƣờng dịch thể của chủng BL4 là cao nhất đạt 20 µg/l, sau đó đến chủng BL2 đạt 17 µg/l và chủng BL7 đạt 15 µg/l và thấp nhất là chủng BL15 đạt 4 µg/l. Nhƣ vậy, 3 chủng BL2, BL4 và BL7 có hoạt tính phân giải lân cao đƣợc lựa chọn sử dụng cho việc nghiên cứu và đánh giá tiếp.
Hình 5. Hình ảnh chuẩn bị mẫu đo hàm lượng lân tan trong dịch nuôi cấy vi sinh vật
Nhƣ vậy, từ 21 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải lân phân lập đƣợc từ các mẫu đất trồng chè của tỉnh Yên Bái (5 chủng của huyện Văn Chấn, 12 chủng của huyện Trấn Yến và 4 chủng ở huyện Yên Bình), đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng vi khuẩn BL2, BL4, BL7 có hoạt tính phân giải lân cao và ổn định sau nhiều lần cấy truyền.
Để làm thuần các tế bào, dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho vào ống nghiệm chứa 4,5ml nƣớc cất vô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến khi đạt đƣợc độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trƣờng đặc hiệu, gạt đều và ủ cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu đƣợc giống thuần khiết. Cấy truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ giống.
Từ 15 chủng vi khuẩn phân giải lân thu đƣợc sau khi phân lập và làm sạch, tiến hành chọn lọc đã thu đƣợc 3 chủng BL2, BL4, BL7 có đặc tính mong muốn. Sự chọn lọc này đƣợc tiến hành theo các tiêu chuẩn sau:
- Đảm bảo độ ổn định về mặt hoạt tính qua thời gian. -Có hoạt tính phân giải hợp chất phốtpho vô cơ khó tan cao. -Có khả năng tồn tại trong chất mang khi sản xuất chế phẩm. - Đảm bảo độ ổn định hoạt tính qua thời gian.
Hình 6: Hoạt tính phân giải hợp chất phốtpho vô cơ khó tan của một số chủng vi khuẩn
Để kiểm tra khả năng sinh trƣởng trong chất mang than bùn của 3 chủng, đã tiến hành nhiễm các chủng này vào chất mang than bùn và theo dõi sự thay đổi của chúng ở 300C thu đƣợc kết quả ở bảng 14:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 14: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân giải các hợp chất phốtpho vô cơ khó tan
STT Ký hiệu chủng
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Hình dạng Kích cỡ Màu sắc
1 BL2 Nhày, lồi To Trắng đục
2 BL4 Phẳng, nhãn Trung Bình Trắng đục
3 BL7 Lồi, nhầy To Trắng
Kết quả cho thấy , tất cả 3 chủng vi khuẩn đều phát triển mạnh trên môi trƣờng các hợp chất phốt pho khó tan , hình dạng , kích cỡ và mầu sắc khuẩn lạc đều đặc chƣng của loại vi khuẩn này.
4.1.1.3. Phân lập, tuyển chọn VSV sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật
Mẫu đất sau khi thu về đƣợc xử lý, hòa tan và pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi cấy vào đĩa pettri có chứa môi trƣờng đặc hiệu. Ủ đĩa ở 300
C, sau 24giờ dùng kẹp vô trùng lấy miếng giấy thấm (cắt hình tròn có diện tích bằng đĩa pettri) đặt lên mặt thạch ủ tiếp. Sau 48 giờ lấy miếng giấy lọc đặt chồng lên miếng giấy lọc khác đã đƣợc làm ƣớt bằng thuốc thử Salkopwski. Quan sát và giữ lại những khuẩn lạc vi khuẩn có sự thay đổi màu sang hồng hoặc đỏ. Kết quả thu đƣợc 18 chủng có khả năng làm chuyển màu giấy lọc có tẩm thuốc thử Salkowski.
Hình 7: Sự chuyển màu giấy lọc tẩm thuốc thử Salkowski dưới tác dụng các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhằm tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh IAA tƣơng đối ổn định, đã tiến hành làm thuần và cấy truyền 5 lần liên tiếp trên môi trƣờng đặc hiệu.
Hình 8: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng khi cấy truyền
Kết quả từ các chủng ban đầu chỉ chọn lọc đƣợc 13 chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh IAA tƣơng đối ổn định sau 5 lần cấy truyền. Các chủng còn lại chỉ duy trì đƣợc hoạt tính sinh IAA sau 1-3 lần cấy truyền. Điều này xảy ra có thể là do các chủng mất hoạt tính đó không phù hợp với điều kiện nuôi cây nhân tạo hoặc có thể do các chủng đó có khả năng sinh IAA quá thấp, nên sẽ bị mất hoạt tính sau vài lần cấy truyền.
Để có thể ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh vật đa chức năng, thì các chủng vi khuẩn sinh IAA không những phải có hoạt tính tƣơng đối ổn định mà còn phải có hoạt tính sinh IAA cao. Do đó, đã tiến hành định lƣợng để xác định hàm lƣợng IAA thô đƣợc sinh ra theo phƣơng pháp so màu ở bƣớc sóng 530nm. Hàm lƣợng IAA đƣợc tính toán dựa theo đồ thị chuẩn. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 15:Hàm lượng IAA hình thành trong dung dịch nuôi cấy các chủng vi sinh vật (g/ml)
STT Ký hiệu chủng
Hàm lƣợng IAA hình thành trong dung dịch nuôi cấy các chủng vi sinh vật (g/ml) 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
1 Đối chứng 0.86 0.86 0.86 0.86 2 KT1 30.61 40.06 43.33 50.13 3 KT2 60.47 65.48 72.56 70.20 4 KT3 38.42 40.20 42.68 40.20 5 KT4 45.03 52.16 55.36 63.45 6 KT5 14.65 15.34 17.10 15.38 7 KT6 60.67 74.81 73.65 80.72 8 KT7 105.48 110.90 134.70 132.28 9 KT8 40.68 35.81 38.65 34.72 10 KT9 80.37 83.46 88.60 89.42 11 KT10 16.42 16.75 16.62 16.79 12 KT11 22.07 15.12 20.97 21.64 13 KT12 25.65 26.07 25.57 22.73 14 KT13 15.33 15.78 27.56 31.50
Kết quả bảng 15 cho thấy, trong 13 chủng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc thì chỉ có 6 chủng là KT1; KT2; KT4; KT6; KT7; KT9 có khả năng sinh IAA mạnh. Sau 5 ngày nuôi cấy lắc, hàm lƣợng IAA trong dung dịch đều đạt trên 50g/ml, trong đó chủng có khả năng sinh IAA mạnh nhất là chủng KT7 với hàm lƣợng IAA trong dung dịch đạt 132.28 g/ml. Các chủng còn lại khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
năng sinh IAA thấp, hàm lƣợng IAA trong dung dịch sau 5 ngày nuôi cấy chỉ đạt từ 15.38 – 40.20 g/ml.
Nhƣ vậy, từ các mẫu đất đã phân lập đƣợc 6 chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA cao, có thể ứng dụng để sản xuất phân bón vi sinh vật đa chức năng.
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 6 chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA tuyển chọn đƣợc thể hiện ở bảng 16.
Hình 10: Hình thái khuẩn lạc của các chủng có khả năng sinh IAA Bảng 16: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng có khả năng sinh IAA
STT Ký hiệu chủng
Nguồn gốc mẫu đất
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Hình dạng Kích cỡ Màu sắc
1 KT1 Trấn Yên Gấp nếp Trung bình Trắng đục
2 KT2 Trấn Yên Nhày Trung bình Trắng đục
3 KT4 Yên Bình Phẳng, nhẵn To Trắng
hồng
4 KT6 Văn Chấn Chảy Trung bình Vàng nhạt
5 KT7 Văn Chấn Tròn, lồi,
nhầy
Trung bình Vàng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua hình 10 và bảng 16 cho thấy, các chủng phân lập có nhiều mầu sắc khuẩn lạc khác nhau, kích thƣớc khuẩn lạc từ trung bình đến to.
4.2. Lƣ̣a chọn các chủng vi sinh vật để sản xuất phân bón hƣ̃u cơ
Trên cơ sở các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao về cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trƣởng , tác giả đã lựa chọn có định hƣớng tổ hợp các chủng để nghiên cƣ́u tiếp theo . Tổ hợp gồm các chủng: kích thích sinh trƣởng KT7; phân giải lân BL2 và cố định nitơ YB03;
4.3. Nghiên cứu các thông số kỹ thuật tối ƣu cho sự sinh trƣởng của các chủng vi sinh vật trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của tổ hợp vi sinh vật tuyển chọn
4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng
Trên cơ sở nguồn chủng giống VSV tuyển chọn, đề tài tiến hành nghiên cƣ́u nhân sinh khối các chủng VSV . Trƣớc tiên, tiến hành các nghiên cứu lựa chọn môi trƣờng phù hợp để nhân sinh khối VSV, nhằm đạt sinh khối vi sinh vật tối đa khi lên men, hoạt tính sinh học đƣợc ổn định và giá thành rẻ, đáp ứng với yêu cầu của sản xuất. Đề tài đã sử dụng các nguồn dinh dƣỡng tổng hợp và nguồn dinh dƣỡng tự nhiên dễ kiếm, rẻ tiền tạo ra 2 môi trƣờng SX1 và SX2 để nuôi cấy nhân sinh khối các chủng VSV. Nuôi cấy lắc 3 chủng KT7; BL2 và YB03 phân lập đƣợc trong bình tam giác trên các môi trƣờng dịch thể Asby, AT, Pikovskaia, SX1 và SX2. Sau 7 ngày, kiểm tra mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy. Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 17.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 17: Mật độ tế bào của các chủng Azotobacter tuyển chọn trên các môi trường dinh dưỡng
TT Kí hiệu chủng
Mật độ tế bào (x 107 CFU/ml) của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng
Asby AT Pikovskaia SX1 SX2
1 YB03 11 - - 10 5,5
2 KT7 33 - 32 7,0
3 BL2 - 19 18 10
Kết quả kiểm tra cho thấy, trên các môi trƣờng đặc hiệu Asby, AT, Pikovskaia và sản xuất SX1, SX2, các chủng vi sinh vật đều sinh trƣởng, phát triển tốt, mật độ tế bào đều đạt tƣ̀ 108 đến 109
CFU/ml. Môi trƣờng sản xuất SX1 tƣơng đƣơng với các môi trƣờng đặc hiệu . Nhƣ vậy, có thể sử dụng môi trƣờng sản xuất SX1 để làm môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn.
4.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật vì mỗi loại vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng, phát triển ở pH môi trƣờng khác nhau. Để lựa chọn pH môi trƣờng tối ƣu cho vi sinh vật phát triển, đề tài đã điều chỉnh giá trị pH môi trƣờng ở các giá trị khác nhau. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đƣợc tổng hợp trong bảng 18.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 18. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật
pH Mật độ tế bào các chủng vi sinh vật (x107
CFU/ ml) YB03 BL2 KT7 5,0 0,03 0,04 0,07 5,5 0,26 0,23 0,26 6,0 5,17 3,59 3,59 6,5 438 436 643 7,0 335 563 561 7,5 563 361 437 8,0 0,32 0,42 0,27
Số liệu ở bảng 18 cho thấy, các chủng vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng và phát triển trong dải pH từ 5,0 đến 8,0 song mật độ tế bào tế bào các chủng vi sinh vật cao nhất khi pH môi trƣờng nằm trong dải từ 6,5 đến 7,5.
4.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy
Nhiệt độ môi trƣờng với vi sinh vật luôn có mối quan hệ mật thiết, vì nhiệt độ không chỉ đơn thuần ảnh hƣởng đến cƣờng độ phát triển của từng loại vi sinh vật mà còn ảnh hƣởng đến chính khả năng sinh trƣởng của chúng ở nhiệt độ đó. Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích và tối đa đƣợc khác nhau.
Để xác định nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men nhân sinh khối, các chủng vi sinh vật đƣợc lên men ở các nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đƣợc tổng hợp trong bảng 19.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật
Nhiệt độ (0C)
Mật độ tế bào các chủng vi sinh vật (x107
CFU/ ml) YB03 BL2 KT7 20 0,07 0,03 0,06 25 365 452 357 30 437 376 476 35 0,83 0,23 0,31 40 0,02 0,05 0,07
Số liệu ở bảng 19 cho thấy, các chủng vi sinh vật đều sinh trƣởng và