3.4.1. Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật
Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
Azotobacter đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dịch bán lỏng (4 ml môi trƣờng trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng bơm tiêm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen. Ủ mẫu qua 24h rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí.
Kết quả tính toán đƣợc thực hiện theo công thức:
Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ đƣợc thể hiện bằng lƣợng Etylen tạo thành V1: Lƣợng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn
V2: Thể tích bình đựng mẫu
V3: Thể tích khí Etylen chuẩn đã hoà loãng đƣợc bơm vào máy V4: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn
V5: Thể tích mẫu bơm vào máy
L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch Etylen chuẩn trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 106: Hệ số chuyển số ml khí Etylen sang số µmol khí Etylen
3.4.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải lân của vi sinh vật
Để xác định khả năng phân giải lân ngƣời ta dùng các kỹ thuật sau:
a. Quan sát khả năng cho vòng trên đĩa pettri
Theo Gerretsen, Sundra Rao và Kucey thì có thể dựa vào vòng trong suốt và thời gian xuất hiện vòng trong để xác định sơ bộ hoạt tính phân giải của từng chủng vi sinh vật. Hiệu số giữa độ rộng vòng trong cực đại (D) và độ rộng của khuẩn lạc (d) biểu thị hoạt tính phân giải các hợp chất phốtpho vô cơ khó tan tƣơng đối của các chủng vi sinh vật.
V1.V2.V3.L1.10-6
V4.V5.L2.22,4 M =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
b. Thông qua hàm lượng P2O5 hòa tan trong dịch nuôi cấy (phương pháp so màu “ Xanh molipden”)
Nguyên lý của phƣơng pháp: Ion phốtpho trong môi trƣờng axit yếu kết hợp với amoni molipdat phức dị đa axit – phốtphomolipdat. Khi thêm vào chất khử mạnh (nhƣ SnCl2 trong HCl hoặc axit ascorbic) thì molipden hóa trị 6 bị khử đến hóa trị 5 và các hóa trị thấp hơn, đồng thời tạo màu xanh phốtpho molipden. Lúc đó dung dịch có màu xanh da trời. Cƣờng độ màu tỷ lệ với hàm lƣợng phốtpho trong dung dịch và có thể xác định bằng cách so màu.
- Hóa chất: Dung dịch (NH4)2MoO4 trong H2SO4 10N. Dung dịch axit Ascobic 1%
Dung dịch Chuẩn P2O5.
- Cách làm dung dịch chuẩn P2O5:
Cân chính xác 0.1917g KH2PO4 vào một lít nƣớc cất hai lần trong bình định mức. Dung dịch P2O5 tiêu chuẩn có hàm lƣợng P2O5 là 0,1mg/ml. Từ dung dịch chuẩn này pha loãng ra 10 lần để tạo dung dịch chuẩn để sử dụng có hàm lƣợng 0.01mg P2O5/ml.
- Dựng đƣờng chuẩn P2O5.
Từ dung dịch chuẩn sử dụng, hút vào mỗi bình định mức 100ml với các thể tích khác nhau nhƣ sau: 2ml, 4ml, 6ml, 8ml (tƣơng ứng với 0.02mg: 0,04mg, 0,06mg, 0,08mg P2O5). Thên nƣớc cất 2 lần vào các bình trên đến thể tích xấp xỉ 50ml và lắc đều. Một bình định mức làm đối chứng chỉ có nƣớc cất. Thêm vào các bình định mức trên mỗi bình 2ml dung dịch amoni molipdat và 3ml dung dịch axit ascobic 1% sau đó lắc đều. Đặt tất cả các bình lên bếp cách thủy đun trong 15 phút. Trong quá trình đun sẽ xuất hiện phức màu xanh molipden. Để nguội và dẫn nƣớc cất đến vạch định mức. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy so màu có bƣớc song α = 650nm. Xử lý kết quả sau khi đo ta sẽ nhận đƣợc đồ thị chuẩn P2O5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Định lƣợng phốtpho trong dịch nuôi cấy.
Nhiễm các chủng vi sinh vật đã đƣợc làm tƣơi qua đêm vào môi trƣờng dịch thể Gerretsen và nuôi trong một tuần.
Ly tâm mẫu thí nghiệm và đối chứng ở tốc độ 10.000vòng/phút trong 10 phút ở 100C sau đó thu dịch trong. Hút 0,5ml dịch trong để định lƣợng. Sau khi đo OD của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng. Mật độ quang học (OD) thực tế bằng hiệu của hai mật độ quang học trên. Căn cứ vào đƣờng chuẩn P2O5 tính đƣợc định lƣợng của P2O5 hòa tan.
3.4.3. Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô của vi sinh vật
Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của vi sinh vật đƣợc xác định theo phƣơng pháp Salkowsky cải tiến (Misra và cs, 1989).
Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu đƣợc dịch trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến. Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bƣớc sóng 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến màu đỏ tuỳ theo hàm lƣợng IAA trong dịch nuôi cấy. Chỉ số OD đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lƣợng IAA có trong dung dịch nuôi cấy.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml H2SO4 98% 300 ml Nƣớc cất 500 ml
+ Làm thuần và giữ lại các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Phƣơng pháp định lƣợng xác định hàm lƣợng IAA thô đƣợc sinh ra Hàm lƣợng IAA thô sinh ra đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu ở bƣớc sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô (đã xác định theo phƣơng pháp định tính ở trên) đƣợc nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trên môi trƣờng nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi hàm lƣợng IAA sinh ra sau thời gian là 2, 3, 4, 5 ngày.
+ Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau các thời gian nuôi cấy (2, 3, 4, 5 ngày) đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút. Sau ly tâm để yên dịch trong 20 phút rồi hút dịch đã ly tâm vào các lọ penicilin đã khử trùng và giữ trong tủ lạnh sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
+ Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0.025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nƣớc cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nƣớc cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lƣợt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 l nƣớc cất đồng thời bổ sung lƣợng IAA tƣơng ứng với lƣợng nƣớc cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nƣớc cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
+ Xác định hàm lƣợng IAA sinh ra
Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trƣờng và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bƣớc sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
3.4.4. Xác định một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính của các chủng vi sinh vật:
Đƣợc xác định theo các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật thông thƣờng.
3.4.5. Nghiên cứu khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong đất trồng chè Shan Yên Bái trong đất trồng chè Shan Yên Bái
a) Xác định các chỉ tiêu lý, hóa, sinh học đất trồng chè Shan theo các phương pháp chuẩn đã được công bố: pH, độ ẩm, % OM, NPK tổng số, mật độ tế bào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
VSV tổng số, vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng.
- Phƣơng pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960- 1995; TCVN 4046: 1985
- Phƣơng pháp xác định OM theo TCVN 4050-1985.
- Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số theo TCVN 4051-1985. - Phƣơng pháp xác định Kali tổng số theo TCVN 5255-2009. - Phuơng pháp xác định phốtpho tổng số theo TCVN 4052- 1985. - Phƣơng pháp xác định độ ẩm theo 10 TCN 380-99.
- Phƣơng pháp xác định độ pH theo TCVN 4401-1987.
- Phƣơng pháp xác định vi khuẩn tổng số, nấm tổng số, xạ khuẩn tổng số theo TCVN 4884 – 2005.
- Phƣơng pháp xác định vi sinh vật phân giải lân theo TCVN 6167 – 1996. - Phƣơng pháp xác định vi sinh vật cố định nitơ theo TCVN 6166 – 2002.
b) Các chủng vi sinh vật tuyển chọn sau khi nhân sinh khối 48 giờ, tẩm nhiễm vào đất khử trùng để diệt tác nhân sinh học trong đất (VSV) và đất không khử trùng. Công thức đối chứng không nhiễm vi sinh vật tuyển chọn.
Sau các thời gian khác nhau 7, 15, 30, 60, 90 ngày, xác định mật độ tế bào và hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn.
3.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đến sinh trưởng, phát triển cây chè Shan.
- Thí nghiệm trong nhà lƣới: để đánh giá ảnh hƣởng của nhóm vi sinh vật hữu ích nghiên cứu (cố định nitơ, kích thích sinh trƣởng, phân giải lân) đến sinh trƣởng cây chè Shan giai đoạn vƣờn ƣơm. Ảnh hƣởng này đƣợc biểu hiện trên cây thông qua các chỉ tiêu sinh trƣởng đƣợc đo đếm trực tiếp.
Cây chè con 1 tuổi đƣợc trồng trong các bầu đất có khối lƣợng đất là 2 kg Thí nghiệm đƣợc bố trí với 8 công thức 3 lần nhắc lại trên các bô đất thí nghiệm không khử trùng, thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CT1: Không bón NPK, không nhiễm vi sinh vật CT2: Bón phân NPK, không nhiễm vi sinh vật CT3: Nhiễm vi sinh vật cố định Nitơ + NPK
CT4: Nhiễm vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật + NPK CT5: Nhiễm vi sinh vật phân giải lân + NPK.
CT6: Nhiễm vi sinh vật cố định Nitơ + Kích thích sinh trƣởng + phân giải lân + NPK.
CT7: Nhiễm vi sinh vật cố định Nitơ + Kích thích sinh trƣởng + phân giải lân + bón 80 % NP và 100 % K.
CT8: Nhiễm vi sinh vật cố định Nitơ + Kích thích sinh trƣởng + phân giải lân + bón 90 % NP và 100 % K.
Các công thức xử lý nhiễm vi sinh vật: các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy lắc 48 giờ trong các môi trƣờng thích hợp cho từng chủng, sau đó đƣợc nhiễm vào bô đất, đảm bảo mật độ tế bào VSV đạt 106
CFU/ g đất. Lƣợng phân bón cho cây chè tính cho 1ha (tƣơng đƣơng 3.000.000 kg đất) là: 40 kg N, 30 kg P2O5, 30 kg K2O.
Các chỉ tiêu theo dõi: sinh trƣởng và phát triển của cây chè (chiều cao cây, số cành cấp 1, đƣờng kính gốc) đƣợc tiến hành theo dõi trong thời gian 1- 2 tháng theo phƣơng pháp quan sát và đo đếm trực tiếp.
3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý thống kê toán học theo IRRISAT 4.0 và chƣơng trình EXCEL 2003
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích
4.1.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích
4.1.1.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter cố định Nitơ từ các mẫu đất
Từ các mẫu đất thu đƣợc, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi trang lên môi trƣờng thạch đặc hiệu, ủ ở nhiệt độ 20-300
C sau 3-7 ngày. Tiến hành chọn những khuẩn lạc có hình thái điển hình của loài Azotobacter
(lồi, đàn hồi, hơi nhầy, khi non có màu trắng khi già có màu xẫm dần) và giữ trong nƣớc cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả đã phân lập đƣợc 17 chủng Azotobacter với đặc điểm hình thái đƣợc trình bày ở bảng 10.
Hình 2: Phân lập các chủng Azotobacter
Bảng 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azotobacter mới phân lập
STT Ký hiệu
chủng Nguồn gốc phân lập
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 1 VC01 Đất trồng chè huyện Văn Chấn Lồi, nhày, trắng 2 VC02 Đất trồng chè huyện Văn Chấn Lồi, trắng trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 VC03
Đất trồng chè huyện Văn Chấn
Lồi, hơi nhày, trắng sữa
4 VC04
Đất trồng chè huyện Văn Chấn
Lồi, nhày, trắng sữa
5 TY01 Đất trồng chè huyện Trấn Yên Lồi, trắng ngà 6 TY02 Đất trồng chè huyện Trấn Yên Lồi, trắng, nhày 7 TY03 Đất trồng chè huyện Trấn Yên Lồi, trắng trong 8 TY04 Đất trồng chè huyện Trấn Yên
Lồi, trắng, hơi nhày
9 TY05
Đất trồng chè huyện Trấn Yên
Lồi, nhày, trắng trong
10 TY06 Đất trồng chè huyện Trấn Yên Lồi, trắng đục 11 YB01 Đất trồng chè huyện Yên Bình Trắng, không nhày, dẹt 12 YB02 Đất trồng chè huyện Yên Bình Dẹt, nhày, trắng ngà 13 YB03 Đất trồng chè huyện Yên Bình Tròn, nhày, trắng trong 14 YB04 Đất trồng chè huyện Yên Bình Tròn, trắng, không nhày, dẹt 15 YB05 Đất trồng chè huyện Yên Bình
Tròn, nhày lồi, trắng xanh
16 YB06
Đất trồng chè huyện Yên Bình
Lồi, hơi nhày, trắng sữa
17 YB07
Đất trồng chè huyện Yên Bình
Tròn, nhày lồi, trắng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả bảng 10 cho thấy, tại các vùng đất trồng chè có pH đất trồng thấp ≤ 5,5 vẫn phát hiện thấy các chủng Azotobacter trong các mẫu đất thu thập từ các vùng đất trồng khác nhau ở Yên Bái.
Từ kết quả bảng 10 có thể nhận thấy rằng, quần thể chi Azotobacter
rất đa dạng về hình thái cũng nhƣ màu sắc khuẩn lạc, trong 17 chủng phân lập đƣợc thì mỗi chủng đều có những đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trƣng riêng. Qua đó có thể thấy quần thể vi khuẩn Azotobacter tại Yên Bái nói riêng và tại Việt Nam nói chung là rất đa dạng, đây chính là một trong những nguồn vsv hữu ích để sản xuất phân hữu cơ vi sinh, hƣớng tới một nền nông nghiệp hữu cơ thân thiện với môi trƣờng.
Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập đƣợc ở trên, đã tiến hành nuôi cấy 17 chủng vào môi trƣờng bán lỏng AT ở 300C trong 24 giờ. Sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả trong 24 chủng mới phân lập đƣợc có 3 chủng có hoạt tính khử axetylen cao nhất. Hoạt tính khử axetylen của từng chủng đƣợc thể hiện ở bảng 11 và hình 4.
Bảng 11: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter.
STT Ký hiệu chủng Cố định nitơ(µmol Etylen/ml/ngày)
1 VC01 186,2 2 VC02 51,4 3 VC03 423,9 4 VC04 27,6 5 TY01 112,0 6 TY02 342,7 7 TY03 87,2 8 TY04 81,6 9 TY05 52,6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 TY06 12,4 11 YB01 156,1 12 YB02 106,6 13 YB03 427,2 14 YB04 111,5 15 YB05 81,7 16 YB06 96,1 17 YB07 81,9
Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter
0 100 200 300 400 500 VC 01 VC 03 TY 01 TY 03 TY 05 YB 01 YB 03 YB 05 YB 07 Tên chủng C ố đị nh ni tơ (µ m ol E ty le n/ m l/ ng à y ) Cố định nitơ(µmolEtylen/ml/ngày)
Biểu đồ 2: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter.
Qua bảng 11 và biểu đồ 2 thấy rằng, hoạt tính khử axetylen đạt từ 12,4– 423,9 µmol Etylen/ml/ngày. Có 3 trong 17 chủng có khả năng cố định nitơ cao nhất, đó là các chủng VC03 , TY02, YB03 có thể sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật cho cây chè Shan trên địa bàn tỉnh Yên Bái.
Sau khi sơ tuyển đƣợc 3 chủng Azotobacter, các chủng vi khuẩn này