Bón phân hữu cơ cho chè ngoài việc cung cấp thức ăn cho cây, còn có tác dụng cải thiện tính chất vật lý, hóa học, sinh vật học và chế độ nƣớc trong đất. Nguồn phân hữu cơ gồm có phân chuồng, phân trấp, phân xanh và các nguyên liệu ép xanh (dùng cành lá sau khi đốn vùi vào giữa hai hàng chè).
Ngƣời ta rất coi trọng hiệu quả về sau của việc bón phân hữu cơ cho chè. Kết quả nghiên cứu của N.L.Bziava (1973) cho thấy trung bình 16 năm, phân chuồng làm tăng sản lƣợng búp 18%, phân xanh 16% và phân trấp 9%.
Theo quy trình hiện nay đối với chè kinh doanh 3 năm, bón phân hữu cơ một lần với liều lƣợng 25t/ha.
2.5.6. Một số nguyên tố vi lượng
Sử dụng các nguyên tố vi lƣợng (bo, đồng, mangan, molipđen, kẽm, coban và iôt) vào việc trồng trọt (xử lý các hạt trƣớc khi gieo) và bón vào đất, phun lên lá, có thể tác động mạnh vào các quá trình sinh lý của cây trồng khác nhau, do đó có thể làm tăng năng suất và phẩm chất chè.
Những công trình nghiên cứu của Acnôn (1954), Evan (1956), Grin (1954), Nalia (1951), Nason (1953), Nicôla (1957), Staccây (1955), MacEuroi và Nason (1954) và những ngƣời khác, đều xác nhận là những nguyên tố tham gia vào thành phần nhiếu loại men và là chất hoạt hóa của nhiều loại men ấy. Nhiều nguyên tố vi lƣợng có ảnh hƣởng tốt tới quang hợp: Mn, Cu, B, Co và Mo đẩy mạnh sự tổng hợp diệp lục trong lá và phân giải diệp lục trong tối. B và các nguyên tố khác tăng cƣờng sự tổng hợp Gluxit, làm cho sự tổng hợp và vận chuyển xacharo và các gluxit khác thuận lợi hơn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(Scônich 1955). Mn, Zn, Cu, Mo và trong nhiều trƣờng hợp cả B làm tăng độ hô hấp và tốc độ của quá trình ôxi hóa khử.
Phân vi lƣợng hiện nay đang bắt đầu đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực tế nông nghiệp và đƣợc coi là một khả năng tiềm tàng góp phần đẩy mạnh sự phát triển của ngành trồng trọt và chăn nuôi. Song việc nghiên cứu và sử dụng phân vi lƣợng cho chè còn rất ít. Ở Xrilanca đã nghiên cứu và sử dụng kẽm sunfat hoặc axit kẽm để phun lên lá, hoặc bón borat phối hợp với N, P, K cho chè ở những nơi xác định có hiện tƣợng thiếu kẽm và bo. Kết quả nghiên cứu của Tranturia (1973) cho thấy bón N, P, K phối hợp với 5 kg Zn và 5 kg B, cho 1 ha, làm tăng phẩm chất của chè nguyên liệu... Ở Việt Nam bƣớc đầu đang nghiên cứu ảnh hƣởng của một số nguyên tố vi lƣợng nhƣ Zn, B, Mo, Mn, Cu, đối với sự sinh trƣởng và phát dục của chè, hoặc dùng H3BO4 (0,02%) phun phối hợp với urê (2%) và vôfatôc (0,2%) để trừ sâu và thúc sinh trƣởng cho chè càng cho kết quả tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. 1. Vật liệu nghiên cứu
- Các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ các mẫu đất trồng chè của huyện Văn Chấn, Trấn Yên, Yên Bình tỉnh Yên Bái.
- Các chủng vi khuẩn cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trƣởng có hoạt tính sinh học cao nhận từ đề tài “Nghiên cứu các giải pháp công nghệ sinh học nhằm nâng cao năng suất, chất lượng chè an toàn tại tỉnh Yên Bái”
- Các thiết bị, hóa chất thuộc Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhƣỡng Nông hóa.
- Các môi trƣờng dùng để tuyển chọn các vi sinh vật cố định nitơ tự do, phân giải lân và kích thích sinh trƣởng thực vật:
+ Môi trƣờng Ashby: để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn cố định nitơ tự do Glucose 20g ; K2HPO4 0,2g ; MgSO4.7H2O 0,2g ; NaCl 0,2g ; K2SO4 0,1g ; CaCO3 5g; Thạch 20g ; Nƣớc cất 1000ml ; pH 7 - 7,2.
+ Môi trƣờng Pikovskaia: để phân lập và nhân sinh khối vi khuẩn phân giải lân: Glucose 10g; yeast extract 0,5g; K2HPO4 o,5g; MgSO4 0,3g; Ca3(PO4)2 5g; dung dịch vi lƣợng 2ml; nƣớc cất 1000ml.
+ Môi trƣờng AT: để phân lập và nhân sinh khối vi khuẩn kích thích sinh trƣởng thực vật: CaCO3 20g; Gluco 20g; K2HPO4 0,8g; MgSO4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nƣớc cất 1000ml.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2. 1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích
+ Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính cố định Nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trƣởng thực vật từ đất trồng chè Yên Bái.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi sinh vật tuyển chọn.
3.2.2. Nghiên cứu khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong đất trồng chè Shan Yên Bái trong đất trồng chè Shan Yên Bái
+ Xác định các chỉ tiêu lý, hóa, sinh học đất trồng chè Shan
+ Xác định mật độ tế bào và hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn sau khi nhiễm vào đất trồng chè
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đến sinh trưởng cây chè Shan (thí nghiệm nhà lưới).
+ Đánh giá hiệu quả chế phẩm chứa các chủng vi sinh vật tuyển chọn đến sinh trƣởng cây chè Shan.
+ Xác định khả năng thay thế một phần phân đạm, lân hóa học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong canh tác chè Shan.
3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.3.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ Tháng 3 đến tháng 11 năm 2012
3.3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Tại phòng thí nghiệm và khu nhà lƣới thuộc Bộ môn Vi sinh – Viện Thổ nhƣỡng Nông hóa.
- Xã Suối Giàng – Văn Chấn – Yên Bái
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật
Khả năng cố định nitơ của các chủng vi sinh vật đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí.
Azotobacter đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng dịch bán lỏng (4 ml môi trƣờng trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng bơm tiêm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen. Ủ mẫu qua 24h rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí.
Kết quả tính toán đƣợc thực hiện theo công thức:
Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ đƣợc thể hiện bằng lƣợng Etylen tạo thành V1: Lƣợng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn
V2: Thể tích bình đựng mẫu
V3: Thể tích khí Etylen chuẩn đã hoà loãng đƣợc bơm vào máy V4: Thể tích lọ dùng để hoà loãng khí chuẩn
V5: Thể tích mẫu bơm vào máy
L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch Etylen chuẩn trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 106: Hệ số chuyển số ml khí Etylen sang số µmol khí Etylen
3.4.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải lân của vi sinh vật
Để xác định khả năng phân giải lân ngƣời ta dùng các kỹ thuật sau:
a. Quan sát khả năng cho vòng trên đĩa pettri
Theo Gerretsen, Sundra Rao và Kucey thì có thể dựa vào vòng trong suốt và thời gian xuất hiện vòng trong để xác định sơ bộ hoạt tính phân giải của từng chủng vi sinh vật. Hiệu số giữa độ rộng vòng trong cực đại (D) và độ rộng của khuẩn lạc (d) biểu thị hoạt tính phân giải các hợp chất phốtpho vô cơ khó tan tƣơng đối của các chủng vi sinh vật.
V1.V2.V3.L1.10-6
V4.V5.L2.22,4 M =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
b. Thông qua hàm lượng P2O5 hòa tan trong dịch nuôi cấy (phương pháp so màu “ Xanh molipden”)
Nguyên lý của phƣơng pháp: Ion phốtpho trong môi trƣờng axit yếu kết hợp với amoni molipdat phức dị đa axit – phốtphomolipdat. Khi thêm vào chất khử mạnh (nhƣ SnCl2 trong HCl hoặc axit ascorbic) thì molipden hóa trị 6 bị khử đến hóa trị 5 và các hóa trị thấp hơn, đồng thời tạo màu xanh phốtpho molipden. Lúc đó dung dịch có màu xanh da trời. Cƣờng độ màu tỷ lệ với hàm lƣợng phốtpho trong dung dịch và có thể xác định bằng cách so màu.
- Hóa chất: Dung dịch (NH4)2MoO4 trong H2SO4 10N. Dung dịch axit Ascobic 1%
Dung dịch Chuẩn P2O5.
- Cách làm dung dịch chuẩn P2O5:
Cân chính xác 0.1917g KH2PO4 vào một lít nƣớc cất hai lần trong bình định mức. Dung dịch P2O5 tiêu chuẩn có hàm lƣợng P2O5 là 0,1mg/ml. Từ dung dịch chuẩn này pha loãng ra 10 lần để tạo dung dịch chuẩn để sử dụng có hàm lƣợng 0.01mg P2O5/ml.
- Dựng đƣờng chuẩn P2O5.
Từ dung dịch chuẩn sử dụng, hút vào mỗi bình định mức 100ml với các thể tích khác nhau nhƣ sau: 2ml, 4ml, 6ml, 8ml (tƣơng ứng với 0.02mg: 0,04mg, 0,06mg, 0,08mg P2O5). Thên nƣớc cất 2 lần vào các bình trên đến thể tích xấp xỉ 50ml và lắc đều. Một bình định mức làm đối chứng chỉ có nƣớc cất. Thêm vào các bình định mức trên mỗi bình 2ml dung dịch amoni molipdat và 3ml dung dịch axit ascobic 1% sau đó lắc đều. Đặt tất cả các bình lên bếp cách thủy đun trong 15 phút. Trong quá trình đun sẽ xuất hiện phức màu xanh molipden. Để nguội và dẫn nƣớc cất đến vạch định mức. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy so màu có bƣớc song α = 650nm. Xử lý kết quả sau khi đo ta sẽ nhận đƣợc đồ thị chuẩn P2O5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Định lƣợng phốtpho trong dịch nuôi cấy.
Nhiễm các chủng vi sinh vật đã đƣợc làm tƣơi qua đêm vào môi trƣờng dịch thể Gerretsen và nuôi trong một tuần.
Ly tâm mẫu thí nghiệm và đối chứng ở tốc độ 10.000vòng/phút trong 10 phút ở 100C sau đó thu dịch trong. Hút 0,5ml dịch trong để định lƣợng. Sau khi đo OD của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng. Mật độ quang học (OD) thực tế bằng hiệu của hai mật độ quang học trên. Căn cứ vào đƣờng chuẩn P2O5 tính đƣợc định lƣợng của P2O5 hòa tan.
3.4.3. Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô của vi sinh vật
Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của vi sinh vật đƣợc xác định theo phƣơng pháp Salkowsky cải tiến (Misra và cs, 1989).
Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu đƣợc dịch trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến. Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bƣớc sóng 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến màu đỏ tuỳ theo hàm lƣợng IAA trong dịch nuôi cấy. Chỉ số OD đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lƣợng IAA có trong dung dịch nuôi cấy.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml H2SO4 98% 300 ml Nƣớc cất 500 ml
+ Làm thuần và giữ lại các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Phƣơng pháp định lƣợng xác định hàm lƣợng IAA thô đƣợc sinh ra Hàm lƣợng IAA thô sinh ra đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu ở bƣớc sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô (đã xác định theo phƣơng pháp định tính ở trên) đƣợc nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trên môi trƣờng nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi hàm lƣợng IAA sinh ra sau thời gian là 2, 3, 4, 5 ngày.
+ Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau các thời gian nuôi cấy (2, 3, 4, 5 ngày) đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút. Sau ly tâm để yên dịch trong 20 phút rồi hút dịch đã ly tâm vào các lọ penicilin đã khử trùng và giữ trong tủ lạnh sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
+ Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0.025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nƣớc cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nƣớc cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lƣợt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 l nƣớc cất đồng thời bổ sung lƣợng IAA tƣơng ứng với lƣợng nƣớc cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nƣớc cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
+ Xác định hàm lƣợng IAA sinh ra
Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trƣờng và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bƣớc sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
3.4.4. Xác định một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính của các chủng vi sinh vật:
Đƣợc xác định theo các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật thông thƣờng.
3.4.5. Nghiên cứu khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong đất trồng chè Shan Yên Bái trong đất trồng chè Shan Yên Bái
a) Xác định các chỉ tiêu lý, hóa, sinh học đất trồng chè Shan theo các phương pháp chuẩn đã được công bố: pH, độ ẩm, % OM, NPK tổng số, mật độ tế bào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
VSV tổng số, vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng.
- Phƣơng pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960- 1995; TCVN 4046: 1985
- Phƣơng pháp xác định OM theo TCVN 4050-1985.
- Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số theo TCVN 4051-1985. - Phƣơng pháp xác định Kali tổng số theo TCVN 5255-2009. - Phuơng pháp xác định phốtpho tổng số theo TCVN 4052- 1985. - Phƣơng pháp xác định độ ẩm theo 10 TCN 380-99.
- Phƣơng pháp xác định độ pH theo TCVN 4401-1987.
- Phƣơng pháp xác định vi khuẩn tổng số, nấm tổng số, xạ khuẩn tổng số theo TCVN 4884 – 2005.
- Phƣơng pháp xác định vi sinh vật phân giải lân theo TCVN 6167 – 1996. - Phƣơng pháp xác định vi sinh vật cố định nitơ theo TCVN 6166 – 2002.
b) Các chủng vi sinh vật tuyển chọn sau khi nhân sinh khối 48 giờ, tẩm nhiễm vào đất khử trùng để diệt tác nhân sinh học trong đất (VSV) và đất không khử trùng. Công thức đối chứng không nhiễm vi sinh vật tuyển chọn.
Sau các thời gian khác nhau 7, 15, 30, 60, 90 ngày, xác định mật độ tế bào và hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn.
3.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn đến sinh trưởng, phát triển cây chè Shan.
- Thí nghiệm trong nhà lƣới: để đánh giá ảnh hƣởng của nhóm vi sinh vật hữu ích nghiên cứu (cố định nitơ, kích thích sinh trƣởng, phân giải lân) đến sinh trƣởng cây chè Shan giai đoạn vƣờn ƣơm. Ảnh hƣởng này đƣợc biểu hiện trên cây thông qua các chỉ tiêu sinh trƣởng đƣợc đo đếm trực tiếp.
Cây chè con 1 tuổi đƣợc trồng trong các bầu đất có khối lƣợng đất là 2 kg Thí nghiệm đƣợc bố trí với 8 công thức 3 lần nhắc lại trên các bô đất thí nghiệm không khử trùng, thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CT1: Không bón NPK, không nhiễm vi sinh vật CT2: Bón phân NPK, không nhiễm vi sinh vật CT3: Nhiễm vi sinh vật cố định Nitơ + NPK
CT4: Nhiễm vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật + NPK CT5: Nhiễm vi sinh vật phân giải lân + NPK.