Nguyên tắc
Dùng khoanh giấy lọc tẩm chất thử nghiệm, đặt lên bản thạch đã trải đều vi khuẩn. Hoạt chất sẽ khuếch tán ra môi trường thạch, nếu có hoạt tính kháng khuẩn sẽ
tạo vòng vô khuẩn. Phương pháp này dùng để xác định chất khảo sát có khả năng kháng khuẩn hay không.
Cách tiến hành
Vi khuẩn: Môi trường TSA được chuẩn bị theo công thức, sau đó được phân vào erlen, đem hấp khử trùng, để nguội khoảng 50 0C rồi đổ đĩa chuẩn bị cho thử hoạt tính.
Nấm: Môi trường SDA được chuẩn bị theo công thức, sau đó được phân vào erlen, đem hấp khử trùng, để nguội khoảng 50 0C rồi đổ đĩa chuẩn bị cho thử hoạt tính.
• Chuẩn bị giống thử nghiệm
Giống vi khuẩn thử nghiệm được hoạt hóa trong môi trường TSB, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 24 giờ. Xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang ở
bước sóng 600 nm và điều chỉnh về mật độ khuẩn trong khoảng là 106 – 107 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi tiến hành điều chỉnh độ đục phải dùng ngay.
Nấm mốc: Được cấy trên môi trường thạch nghiêng SDA, ủ ở nhiệt độ 370C trong 7 ngày.
Nấm men: Được hoạt hóa trong môi trường SDB, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 3 ngày. Xác định mật độ nấm men bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và điều chỉnh về mật độ nấm trong khoảng là 106 – 107 CFU/ml.
• Chuẩn bịđĩa giấy và dung môi hòa tan mẫu
Sử dụng đĩa giấy có đường kính 5mm đã được hấp khử trùng, sau đó sấy khô. Dùng DMSO 100% làm dung môi hòa tan các mẫu cao.
Tetracylin và clotrimazol cũng được hòa tan hoàn toàn trong DMSO 100%.
• Chuẩn bị chất thử nghiệm Thuốc kháng khuẩn: Tetracylin Thuốc kháng nấm: Clotrimazol
Các mẫu cao cồn 96% và 45% hòa tan trong DMSO 100%. Tinh dầu hòa tan trong aceton
Bảng 2.6: Thứ tựđặt đĩa giấy trên các mẫu cao Thứ tựđặt đĩa giấy Chất thử nghiệm Nồng độ 1 Cao TNK dược dụng chiết trong cồn 45% (TNK-DD 45%) 1 mg/ml 2 Cao TNK cuống xanh chiết trong cồn 45% (TNK-Xanh 45%) 1 mg/ml 3 Cao TNK cuống đỏ chiết trong cồn 45% (TNK-Đỏ 45%) 1 mg/ml 4 Cao TNK dược dụng chiết trong cồn 96% (TNK-DD 96%) 1 mg/ml 5 Cao TNK cuống xanh chiết trong cồn 96% (TNK-Xanh 96%) 1 mg/ml 6 Cao TNK cuống đỏ chiết trong cồn 96% (TNK-Đỏ 96%) 1 mg/ml • Trên các mẫu tinh dầu Bảng 2.7: Thứ tựđặt đĩa giấy trên các mẫu tinh dầu Thứ tựđặt đĩa giấy Chất thử nghiệm Nồng độ 1 TNK-DD 2 Chứng âm DMSO
3 TNK-Xanh 4 TNK-Đỏ 5 Chứng dương Tetracylin 1 mg/ml Chứng dương Clotrimazol 1 mg/ml Tiến hành
Dùng pipetman hút 100 µl dịch vi khuẩn, nấm men đã chuẩn bị cho vào đĩa petri chứa môi trường TSA, SDA đã chuẩn bị, sau đó dùng que trải thủy tinh trải đều.
Đối với nấm mốc, thực hiện bằng phương pháp cấy điểm. Tiến hành đặt đĩa giấy.
Dùng pipetman hút 5 µl chất thử nghiệm cho từ từ thấm đều vào đĩa giấy. Thao tác tiến hành đảm bảo điều kiện vô trùng.
Sau đó đem ủở 37 0C. Đối với vi khuẩn ủ trong 1 ngày, nấm men 2 ngày, nấm mốc 7 ngày.
Sau thời gian ủ, khuẩn mọc thành lớp, không tạo nhóm riêng lẻ, căn cứ vào vị trí
đặt đĩa giấy có chất thử nghiệm ta đọc kết quả.
Chất thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm khi tạo vòng kháng trong suốt quanh đĩa giấy và được gọi là đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm. Đối với nấm mốc sẽ là đường kính vòng không tơ.
Tiến hành đo đường kính kháng khuẩn, kháng nấm để xác định mẫu thử nghiệm nào có hoạt tính mạnh nhất.
Kết quảđược ghi nhận bằng hình ảnh và đường kính vòng vô khuẩn.
Đường kính vòng vô khuẩn (ĐKVK) được tính theo công thức:
ĐKVK = VK mẫu thử - VK chứng âm
Kết quả kháng khuẩn được đánh giá dựa trên tỷ lệ của vòng vô khuẩn tính theo công thức RoJas
2.2.8. Phương pháp MIC Nguyên tắc Nguyên tắc
Chất thử nghiệm được pha loãng với dãy nồng độ giảm dần ½. Tại nồng độ thấp nhất không có sự phát triển của khuẩn được xem là nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử nghiệm đối với chủng khuẩn đó.
Cách tiến hành
MIC của mẫu thử được khảo sát bằng phương pháp vi pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng.
Chất thử nghiệm: các mẫu cao chiết và tinh dầu. Chuẩn bị giống thử nghiệm.
Sử dụng phiến vi lượng 96 giếng bán trên thị trường, đã được khử trùng bằng cồn, nhiệt và khử trùng lại bằng đèn UV trong 30 phút để tiến hành khảo sát dãy nồng
độ (MIC) của chất thử nghiệm trên các chủng khuẩn và nấm nhạy cảm với chất thử
nghiệm trong phương pháp khuếch tán.
Dùng pipetman hút cho vào giếng 100 µl môi trường chứa khuẩn ở mật độ
khoảng 106 – 107 CFU/ml.
Lần lượt cho thêm vào từng giếng mẫu thử nghiệm như sau:
• Đối với các mẫu cao chiết: Pha một dung dịch ban đầu với nồng độ 1000 µg/ml, dung môi là DMSO và nước cất.
% VK =
ĐKVK mẫu thử
Bảng 2.8: Quy trình khảo sát MIC của mẫu cao Mẫu thử (µl) Nước cất (µl) Môi trường chứa
khuẩn (µl) Nồng độ mẫu thử trong giếng(µg/ml) 100 0 100 500 50 50 100 250 25 75 100 125 12,5 87,5 100 62,5
• Đối với tinh dầu: Pha một dung dịch ban đầu với nồng độ 5000 µg/ml (với dung môi là aceton), sau đó pha loãng ra với aceton 30% thành các nồng độ
giảm dần.
Bảng 2.9: Quy trình khảo sát MIC của mẫu tinh dầu Mẫu thử (µl) Môi trường chứa khuẩn (µl) Nồng độ mẫu thử trong giếng (µg/ml) 20 180 500 20 180 400 20 180 300 20 180 200
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Vi học