Nguyên tắc
- Cất dược liệu với một dung môi không đồng tan với nước nhưng tạo với nước thành một hỗn hợp có điểm sôi nhất định (hỗn hợp đẳng phí). Tại điểm sôi này nước và dung môi đều bốc hơi. Khi gặp lạnh ở ống sinh hàn, hơi nước và hơi dung môi ngưng tụ lại rơi xuống ống hứng, nước tách ra khỏi dung môi. Nước nặng hơn
dung môi nên chìm xuống phần dưới của ống đo nước. Cất đến khi thể tích của nước không đổi. Đọc thể tích nước. Tính kết quả [3], [6].
- Dung môi thường dùng là: Toluen (điểm sôi 112 0C), xylen (hỗn hợp của 3
đồng phân có khoảng sôi 136 – 140 0C) hay benzen (điểm sôi 80 0C). Tiến hành
- Dụng cụ
Bao gồm: Bình cầu 500 ml, bộ phận xác định lượng nước (bầu ngưng tụ,
ống dẫn hơi, và ống hứng chia vạch), ống sinh hàn và nguồn nhiệt (sử dụng bếp
điện).
- Cách tiến hành
Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước rồi làm khô. Thêm 200 ml toluen và khoảng 2 ml nước vào bình cầu khô. Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút rồi đọc thể tích nước cất được ởống hứng (V1), chính xác đến 0,05 ml.
Thêm vào bình cầu một lượng mẫu thử đã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2 - 3 ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Ðun nóng nhẹ trong 15 phút, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt dịch cất trong 1 giây. Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ
cất lên 4 giọt dịch cất trong 1 giây. Tiếp tục cất cho đến khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa.
Dùng 5 - 10 ml toluen rửa thành trong ống sinh hàn. Cất thêm 5 phút nữa. Tách bộ phận cất ra khỏi nguồn cấp nhiệt, để cho ống hứng nguội đến nhiệt
độ phòng. Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2).
Các mẫu đều được tiến hành lặp lại 3 lần .
Ðộẩm (x %) của dược liệu được tính theo công thức sau:
x% = x% = x% =
100 x (V2 – V1) p
Trong đó: V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: Số ml nước cất được sau lần cất thứ hai p: Số g mẫu đã cân đem thử
Đánh giá kết quả
Dược liệu đạt yêu cầu khi độẩm không quá 14%.
2.2.2.2. Xác định độ tro a. Tro toàn phần a. Tro toàn phần Nguyên tắc
Tro toàn phần là cắn còn lại khi ta đốt cháy hoàn toàn một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxyd [3], [6].
Tiến hành
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén.
Cân chính xác khoảng 1 – 3 g dược liệu cho vào chén nung. Trải đều dược liệu
ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Đặt chén vào lò nung ở 300 – 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng cặp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ
nữa. Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi nhận kết quả. Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệch nhau nhiều nhất 0,5 mg.
Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức: A % =
(c – h) (a – b)
Trong đó: A%: Tro toàn phần của dược liệu (%) a: Khối lượng chén có tro (g) b: Khối lượng chén không (g) c: Khối lượng mẫu thử dùng (g) h: Độẩm của dược liệu (%). Đánh giá kết quả
Dược liệu đạt yêu cầu khi độ tro toàn phần không quá 4%.
b. Tro không tan trong HCl Nguyên tắc
Tro không tan trong HCl là lượng cắn không tan còn lại của tro toàn phần sau khi hòa tan tro toàn phần trong HCl.
Tiến hành
Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào chén nung chứa tro toàn phần 2 - 3 ml dung dịch HCl 10%. Đậy nắp chén nung và đun cách thủy trong 10 phút. Pha loãng phần còn lại trong chén nung với 5 ml nước cất nóng. Lọc qua giấy lọc không tro. Dùng nước cất nóng tráng lấy hết tro còn đọng trong chén và trên nắp chén. Tiếp tục dùng nước cất nóng rửa tro và giấy lọc đến khi dịch lọc trung tính.
Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, nung, để nguội rồi cân như khi xác định tro toàn phần.
Tro không tan trong HCl trên dược liệu khô kiệt theo công thức:
Trong đó:
B%: Tro không tan trong HCl (%) a: Khối lượng chén có tro (g) b: Khối lượng chén không (g) c: Khối lượng mẫu thử dùng (đã trừđộẩm) (g). B% = (a – b) c x 100
Đánh giá kết quả
Dựa vào độ tro không tan trong HCl đánh giá độ lẫn cát, đất của dược liệu.
2.2.3. Khảo sát thành phần hóa học
2.2.3.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Các mẫu dược liệu được phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật theo quy trình phân tích của Ciuley cải tiến (Trường Đại học Dược, khoa Bucarest, Rumani) [5].
a. Nguyên tắc
Chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: Diethyl ether, EtOH 96%, nước. Xác
định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng.
b. Tiến hành
Cân khoảng 10 g dược liệu và chiết lần lượt qua các dung môi diethyl ether, cồn EtOH 96%, nước cất theo quy trình sau:
Hình 2.10: Quy trình phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Alkaloid TT chung Anthraquinon Phản ứng Bornträger Flavonoid Phản ứng Cyanidin Alkaloid TT chung Coumarin Phản ứng huỳnh quang/OH- Glycosid tim TT Raymond-Marthoud Flavonoid γ-pyron Phản ứng Cyanidin
Anthocyanidin HCl 10%→đỏ , KOH10%→ xanh Proanthocyanidin HCl / t0 →có màu đỏ
Tannin FeCl3 5% →xanh rêu /xanh đen,Gelatin muối →tủa bông Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard, tính tạo bọt trong nước Acid hữu cơ Na2CO3 → sủi bọt
Hợp chất khử TT Fehling
Tritrerpenoid Phản ứng Liebermann-Burchard Coumarin Phản ứng huỳnh quang/OH- Anthraquinon Phản ứng Bornträger Glycosid tim TT Raymond-Marthoud Flavonoid γ-pyron Phản ứng Cyanidin
Alkaloid TT chung
Glycosid tim TT Raymond-Marthoud Flavonoid γ-pyron Phản ứng Cyanidin
Anthocyanidin HCl 10%, KOH10%→ đỏ với acid, xanh với kiềm Proanthocyanidin HCl / t0 →có màu đỏ
Tannin FeCl3 5% →xanh rêu /xanh đen,Gelatin muối →tủa bông Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard, tính tạo bọt trong nước Acid hữu cơ Na2CO3 → sủi bọt
Hợp chất khử TT Fehling
Polyuronic Pha loãng trong cồn → tủa bông Tritrerpenoid Phản ứng Liebermann-Burchard Coumarin Phản ứng huỳnh quang/OH- Anthraquinon Phản ứng Bornträger Glycosid tim TT Raymond-Marthoud Flavonoid γ-pyron Phản ứng Cyanidin
Dịch cồn Dịch cồn thủy phân Bã dược liệu Bã dược liệu Dịch nước Dịch nước thủy phân chiết cồn chiết nước HCl 10 %/ C ách th ủ y Ch i ế t l ạ i b ằ ng et her HCl 10 %/ C ách th ủ y Ch i ế t l ạ i b ằ ng et her Dịch nước thủy phân
2.2.3.2. Định tính xác định các nhóm hợp chất
Kết quả của quy trình phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật cho biết các nhóm hợp chất có mặt trong dược liệu. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, các phản ứng định tính của quy trình phân tích sơ bộ không cho phép kết luận một cách chắc chắn sự có mặt hay vắng mặt của một nhóm hợp chất trong nguyên liệu. Vì vậy, các nhóm hợp chất này tiếp tục được định tính bằng phản ứng hóa học và SKLM [5], [9].
a. Định tính bằng phản ứng hóa học
Sau khi định tính sơ bộ, tiến hành xác định từng hợp chất đã phát hiện trong dược liệu bằng cách chiết xuất trực tiếp từ dược liệu rồi xác định bằng các phản ứng
đặc trưng.
9 Định tính coumarin
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 20 ml EtOH 96%, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút, sau đó lọc dịch lọc qua giấy lọc. Lặp lại khoảng 2 lần nữa cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc, cô còn khoảng 10 ml làm các phản
ứng định tính.
Phản ứng đóng mở vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau, mỗi ống 2 ml dịch lọc. - Ống 1: Thêm 4 ml nước cất, dung dịch trở nên đục. - Ống 2: Thêm 6 giọt NaOH 10%.
Đun cách thủy ống 2 trong 2 - 3 phút. Để nguội, thêm vào 4 ml nước cất. Ống 2 sẽ trong hơn ống 1. Acid hóa ống 2 với vài giọt HCl đậm đặc (thử bằng giấy pH) thì dung dịch sẽđục nhưống 1.
Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV
Nhỏ một giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc, chờ khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần nữa. Nhỏ chồng lên đó 1 giọt NaOH 5% sấy khô. Che ½ vết bằng 1 miếng kim loại
rồi đem soi dưới đèn UV365 nm trong vài phút. Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nửa không bị che sáng hơn nửa bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia UV thì sau vài phút thì cường độ
phát quang của 2 bên sẽ sáng như nhau. 9 Định tính glycosid tim
Chiết xuất
Lấy 5 g bột dược liệu ngâm trong một bình nón 100 ml với 30 ml cồn EtOH 25% trong 24 giờ. Sau đó chiết siêu âm nóng khoảng 10 - 15 phút. Gạn hay lọc dịch lọc vào 1 bécher.
Phần bã còn lại được chiết tiếp bằng siêu âm nóng như trên thêm 2 lần nữa, mỗi lần với 15 ml cồn EtOH 25%. Gộp chung các dịch lọc.
Thêm vào dịch chiết 6 ml dung dịch chì acetat 30 %, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc qua giấy lọc. Kiểm tra việc loại tạp bằng cách nhỏ vào dịch lọc 1 giọt dung dịch chì acetat, nếu còn xuất hiện tủa thì phải cho thêm dung dịch chì acetat và lọc lại.
Thêm vào dịch lọc trên 6 ml dung dịch natri sulfat 15%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc lại qua giấy lọc (Kiểm tra việc loại chì acetat thừa bằng 1 giọt natrisulfat).
Dịch lọc sau khi đã loại hết muối chì thừa được lắc với chloroform (10 ml x 2 lần) trong một bình lắng gạn. Gộp chung các dịch chloroform và làm khan bằng Na2SO4 khan.
Xác định phần aglycon
• Xác định khung steroid – Phản ứng Lieberman – Burchard
Cho 1 ml anhydrid acetic vào ống nghiệm có chứa 2 ml dung dịch glycosid tim trong CHCl3, lắc đều. Cho cẩn thận theo thành ống nghiệm hoặc sát xuống đáy ống nghiệm (tránh làm xáo động dung dịch) khoảng 1 ml acid sulfuric đậm đặc. Giữa 2 lớp TT sẽ xuất hiện 1 vòng ngăn cách, phía dưới có màu hồng, phía trên có màu xanh lá tới xanh chàm.
• Xác định vòng lacton 5 cạnh
Phản ứng với thuốc thử Raymond – Marthoud
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Cho vào ống nghiệm có chứa cắn vài giọt TT m - dinitrobezen 1 % trong cồn tuyệt đối, khuấy đều rồi thêm 1 - 2 giọt NaOH 10 % trong cồn, sẽ xuất hiện màu tím không bền. Phản ứng này cũng có thể thực hiện trên giấy lọc hay trên chén sứ.
Phản ứng với TT Kedde
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Hòa cắn với 1 ml cồn EtOH 50 %, sau đó thêm vào 0,4 ml dung dịch 2 % của acid 3,5 - dinitrobenzoic và 0,4 ml dung dịch NaOH 2 %. Dung dịch glycosid tim sẽ có màu tím đỏ.
Xác định phần đường 2 - desoxy
Phản ứng với acid phosphoric đậm đặc
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Hòa cắn vào 1 ml aceton, thêm 5 ml acid phosphoric đậm đặc (d = 1,7), lắc đều rồi đặt trên bếp cách thủy trong 15 phút sau đó làm nguội. Các hợp chất có đường 2 - desoxy cho màu vàng.
9 Định tính flavonoid
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 100 ml. Thêm 25 ml EtOH 95% vào bình.
Đậy nút bông và chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm
- Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% - Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1%
- Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính Thực hiện
Phản ứng của vòng γ- pyron
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm một ít bột Mg kim loại rồi thêm từ từ
2 – 3 ml HCl đậm đặc. Quan sát sự chuyển màu của dung dịch. Phản ứng của nhóm anthocyanin
Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ống thứ 1 thêm 1 giọt HCl 1%,
ống thứ 2 thêm 1 giọt NaOH 1%, ống thứ 3 để nguyên. Quan sát màu của 3 ống nghiệm.
Phản ứng của nhóm leuco - anthocyanidin
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong cồn và 5 giọt HCl đậm đặc. Đun cách thủy trong vòng vài phút, lắc đều. Quan sát màu của dung dịch, so với ống chứng.
9 Định tính tannin
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml nước, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút (nếu dung dịch có nhiều hợp chất polyuronid thì dùng hỗn hợp cồn - nước hay aceton - nước để chiết). Lọc lấy dịch lọc trong. Chiết lặp lại như trên khoảng 2 lần nữa, cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc, cô lại còn khoảng 10 ml, dùng làm các phản ứng định tính.
Định tính chung tanin từ dược liệu – phản ứng với protein
Lấy vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, cho vào vài giọt gelatin muối (dung dịch 1% gelatin trong nước muối 9%). Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục.
Định tính phân biệt 2 loại tannin
Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch chiết nước. Thêm lần lượt các thuốc thử:
- Ống 1: Làm ống đối chứng - Ống 2: 1 giọt TT FeCl3 1%
Quan sát sự tạo màu, tạo tủa của dung dịch để kết luận loại tannin.
Bảng 2.2: Thuốc thử dùng phân biệt 2 loại tannin
Thuốc thử Tannin pyrogallic Tannin pyrocacechic
FeCl3 1% Xanh đen Xanh rêu
Stiasny + đun cách thủy 10 phút Không tủa Tủa vón cục đỏ gạch 9 Định tính triterpenoid
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml cồn EtOH 96%, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút. Lọc lấy dịch lọc trong. Chiết lặp lại như trên khoảng 2 lần nữa, cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc cô tới cắn, dùng làm phản
ứng định tính.
Phản ứng Liebermann - Burchard
Hòa cắn trên với 1 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 1 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển sang màu xanh lục hay tím.
9 Định tính hợp chất polyuronid
Nhỏ từng giọt một 2ml dịch chiết nước vào 1 ống nghiệm chứa 10 ml EtOH 95% (hoặc aceton). Các hợp chất polyuronid sẽ cho tủa bông có từ trắng tới vàng nâu.
Xác định chất nhầy: Nếu có tủa bông được tạo thành ở phản ứng trên, lọc hoặc ly tâm lấy tủa. Rửa tủa bằng cồn EtOH 95%. Tủa được nhuộm với dung dịch xanh methylen, xanh toluidin hay hematoxylin. Tủa nhầy sẽ cho màu tím hay xanh dương.
Lựa chọn dung môi chiết xuất và hệ dung môi khai triển thích hợp, tiến hành SKLM để kiểm tra và định tính các nhóm hợp chất đã được khẳng định là có đối với
định tính bằng phản ứng hóa học [1], [4], [9], [26].