1.3.1. Vi khuẩn Gram âm
Là nhóm vi khuẩn có vách tế bào là peptidoglican chiếm tỉ lệ rất ít (5-10%) Lớp ngoài cùng là hai lớp lipopolisaccharide có đan xen với các phân tử
protein.
Khi tiến hành phương pháp nhuộm Gram, vách tế bào của vi khuẩn không ăn màu Gram (không giữ màu tím) nên được gọi là Gram âm [2], [11].
1.3.1.1. Escherichia coli
Hình 1.4: Escherichia coli
- E.coli là vi khuẩn hiếu khí, hình que, thẳng (1x4 µm), di động hoặc không di động, ưa ẩm.
- Thường gặp trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng.
- Hầu hết các dòng E.coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, ngược lại chúng còn có vai trò ổn định sinh lý
đường tiêu hóa.
- Tuy nhiên một số dòng E.coli mang plasmid gây bệnh nên chúng có khả năng gây bệnh cho người và động vật máu nóng.
• Enteropathogenic E.coli (EPEC) • Enterotoxigenic E.coli (ETEC) • Enteroinvasive E.coli (EIEC) • Enterohaemorhagic E.coli (EHEC)
- Một số bệnh thường gặp như: Tiêu chảy, kiết lỵ, xuất huyết đường tiêu hóa…
1.3.1.2. Pseudomonas aeruginosa
Hình 1.5: Pseudomonas aeruginosa
- P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với tiêm mao đơn cực.
- Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng P. aeruginosa có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử, nhiệt độ
phát triển tối ưu ở 37 0C.
- P. aeruginosa hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt động thực vật.
- Là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người như: viêm đường hô hấp, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tai, nhiễm trùng da…
- P. aeruginosa có khả năng sản xuất ra 2 loại sắc tố hòa tan là pyoverdine và pyocyanine. Sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh nên còn gọi là vi khuẩn mủ xanh.
- P. aeruginosa còn là loài vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng tải nạp và giao nạp, tạo ra những dạng
đột biến kháng thuốc mới.
1.3.2. Vi khuẩn Gram dương
Là nhóm vi khuẩn có tới 50% khối lượng của vách tế bào là peptidoglican. Ngoài ra, acid teicoic là một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn này. Acid teicoic giúp cho việc vận chuyển các ion dương vào, ra tế bào và dự trữ
phosphate.
Khi tiến hành nhuộm Gram, vách tế bào của nhóm vi khuẩn này ăn màu Gram nên được gọi là Gram dương [2], [11].
1.3.2.1. Staphylococcus aureus
Hình 1.6: Staphylococcus aureus
- Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, tế bào hình cầu, đứng một mình, thành cặp hoặc thành đám, không di động,
ưa ẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- S. aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhầy người và động vật máu nóng.
- Hầu hết các dòng S. aureus có khả năng tạo độc tố enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15 0C, độc tố này là nguyên nhân gây nên các vụ ngộđộc thực phẩm.
- Staphylococcus aureus có một dòng có khả năng kháng lại kháng sinh methicillin gọi là MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus). Cơ chế kháng methicillin là do sự có mặt của gen mecA, sản xuất protein mục tiêu gắn methicillin được biến đổi làm giảm ái lực gắn của kháng sinh.
1.3.2.2. Streptococcus pyogenes
Hình 1.7: Streptococcus pyogenes
- Streptococcus pyogenes là những cầu khuẩn, kỵ khí, không có cơ
quan di động và không sinh bào tử, ưa ẩm. Chúng thường đứng thành từng cặp hoặc từng chuỗi dài.
- Streptococcus pyogenes có khả năng sinh ngoại độc tố và enzym streptokinase phá hủy tế bào hồng cầu và gây bệnh ở người như: sốt, phát ban đỏ, viêm họng, amidan, chốc lở…
1.3.3. Nấm mốc Trychophyton mentagrophytes
Hình 1.8: Trychophyton mentagrophytes
- Trychophyton mentagrophytes có dạng chùy, vách mỏng, có nhiều vách ngăn, bào tử đính lớn, khuẩn lạc có màu kem, có mấu ở giữa hoặc gấp nếp mỏng.
- Chúng thường gây ra các bệnh như nấm da, nấm chân, nấm tóc… trên người [2], [11].
1.3.4. Nấm men Candida albicans
Hình 1.9: Candida albicans
- Hình dạng tế bào thay đổi từđơn bào hình bầu dục sang dạng sợi, tế
- C. albicans tồn tại ở 2 dạng hình thái là đơn bào và nấm sợi giúp loài này nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và rất khó bị tiêu diệt.
- C. albicans thường sống vô hại ở màng nhầy người và động vật máu nóng (miệng, ruột, âm đạo) và không thường xuyên ở trên da ở dạng
đơn bào.
- Ở những điều kiện nhất định, nấm men phân hóa thành dạng sợi để
xâm nhập vào màng nhầy, tăng trưởng không kiểm soát và gây những bệnh “nhiễm nấm men” khá nghiêm trọng [2], [11].
1.4. Giới thiệu sắc ký lớp mỏng (SKLM)
SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách [1], [3].
Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích,
được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cốđịnh trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.
Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể
là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha
động.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
Trong đó: a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
1.5. Giới thiệu sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS) là một loại máy sắc ký khí đặc biệt với
đầu dò là một máy phổ khối lượng (MSD). Sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần
được lần lượt cho vào máy phổ khối lượng để thực hiện việc ghi phổ MS của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này được đem đi so sánh với các phổ
MS chuẩn chứa trong thư viện máy vi tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thư viện phổ khối lượng cần có nhiều phổ chuẩn và tốt hơn hết nó phải là một thư viện chuyên ngành tinh dầu. Độ tương hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính chất tương đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thường thì độ tương hợp này càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học của các tinh dầu và kiến thức về phổ khối lượng quyết định rất lớn độ chính xác của kết quảđịnh danh [10].
Đầu dò khối phổ có độ nhạy rất cao, khoảng 10-6 - 10-9 g, do đó có thể xác
định được những cấu phần có hàm lượng rất thấp trong tinh dầu mà các phương pháp khác không thể thực hiện được. Nhưng việc này cũng chỉ có tính chất tương
đối vì với những tinh dầu mà các cấu phần chính có hàm lượng không cao lắm, việc xác định những cấu phần còn lại dễ dàng, nhưng nếu cấu phần chính có hàm lượng quá cao thì việc xác định những cấu phần còn lại trong tinh dầu trở nên khó khăn.
Đôi khi việc xác định các cấu phần còn lại phải được thực hiện trên phần phi cấu phần chính.
Sắc ký khí ghép khối phổ có khả năng định danh cao hơn ghép hồng ngoại vì thư viện phổ lớn hơn rất nhiều, khả năng dò tìm nhanh hơn, lượng mẫu cần cho phần khối phổ rất ít.
1.6. Giới thiệu phương pháp khuếch tán đĩa 1.6.1. Phương pháp đặt khoanh giấy lọc 1.6.1. Phương pháp đặt khoanh giấy lọc
Dùng khoanh giấy lọc tẩm chất thử nghiệm, đặt lên bản thạch đã trải đều vi khuẩn. Hoạt chất sẽ khuếch tán ra môi trường thạch, nếu có hoạt tính kháng khuẩn sẽ tạo vòng vô khuẩn [11], [21], [29].
1.6.2. Phương pháp đục lỗ thạch
Cấy trải đều vi khuẩn vào môi trường, sau đó đục lỗ thạch rồi hút dung dịch thử nghiệm vào giếng thạch đã đục. Chất thử nghiệm sẽ nhanh chóng khuếch tán ra môi trường và dễ dàng xác định được hoạt tính chất thử nghiệm.
1.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory concentration – MIC)
- Dùng cho chất thử nghiệm tan trong môi trường sử dụng, phương pháp này dùng xác định MIC.
- Chất thử nghiệm được pha loãng với các nồng độ khác nhau, sau đó
được trộn đều với môi trường thử nghiệm, tiếp theo cấy khuẩn lên để
xác định hoạt tính với các nồng độ chất thử nghiệm khác nhau.
- MIC của một chất được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu của chất
đó có khả năng ức chế 80 – 100% sự phát triển của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [11], [21], [29].
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu 1: Thân rễ Thiên niên kiện dược dụng, họ Ráy (Araceae), thu mua tại Viện Y Dược Dân Tộc vào tháng 02/2011.
- Mẫu 2: Thân rễ Thiên niên kiện cuống lá xanh, thu hái tại núi Chúa – Côn Đảo vào tháng 12/2010.
- Mẫu 3: Thân rễ Thiên niên kiện cuống lá tím đỏ, thu hái tại núi Chúa – Côn Đảo vào tháng 12/2010.
Các mẫu thân rễđều được loại bỏ rễ phụ, phơi khô và xay thành bột thô.
2.1.2. Dung môi, hóa chất Dung môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chloroform (Trung Quốc) - Methanol (Đức, Trung Quốc) - n - Hexan (Trung Quốc)
- Diethyl ether (Trung Quốc), EtOH 96%, nước cất 2 lần - Toluen (Trung Quốc).
Hóa chất
- Dung dịch m – dinitrobenzen 1% - Dung dịch NaOH 10%, KOH 10%
- Dung dịch H2SO4đậm đặc, HCl đậm đặc
- Na2SO4 khan, dung dịch chì acetat 30%, dung dịch FeCl3 1% - Bột DPPH, Magie kim loại.
Thuốc thử
- Mayer, Bouchadat, Dragendorff
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Bộ dụng cụ xác định hàm lượng nước (Đức) - Bộ dụng cụđịnh lượng tinh dầu 1000 ml (Đức) - Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Đức) - Bếp đun cách thủy MEMMERT (Đức)
- Cân phân tích METLER TOLEDO AB-204 (Thụy Sĩ) - Tủ sấy SANYO MOV-112 (Nhật)
- Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE - Máy cô quay BUCHI R - 114 (Thụy Sĩ)
- Máy đo quang phổ khả kiến Thermo spectronic HEλIOSγ
- Máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS): AGILENT 6890N - 5973 GC - MS - Máy chụp ảnh KTS SAMSUNG - Bình triển khai sắc kí lớp mỏng - Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Đức). - Bình ngấm kiệt - Nồi hấp - Tủ cấy - Tủ 37 0C… - Ống nghiệm, đĩa petri, dụng cụ cấy, đèn cồn… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát vi phẫu dược liệu 2.2.1.1. Mô tả dược liệu
Cảm quan về màu sắc, mùi vị, độ mịn của bột dược liệu.
2.2.1.2. Soi bột
- Lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lam). Cho 1 - 2 giọt KOH 10% vào giữa lam kính, khuấy kỹ. Đậy lamell bằng cách
phân tán đều. Loại bỏ phần KOH và bột thừa bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên lam và lamell [5], [6].
- Làm thêm 1 tiêu bản bột dược liệu trong nước với phương pháp tương tự như
trên.
- Quan sát và ghi nhận kết quả dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại 10x và 40x.
2.2.1.3. Vi phẫu
- Chọn mẫu: Dùng mẫu tươi, không quá già, không quá non.
- Cắt: Cắt ngang bằng lưỡi lam, chọn các lát cắt thật mỏng để nhuộm. - Nhuộm: Dùng phương pháp nhuộm 2 màu lục iod và đỏ son phèn.
• Ngâm các lát cắt vào dung dịch Javel từ 15 – 20 phút (đến khi nào thấy lát cắt trắng), rửa kỹ bằng nước cất 3 – 4 lần.
• Ngâm các lát cắt vào dung dịch acid acetic từ 4 – 5 phút, rửa kỹ bằng nước cất 7 - 8 lần.
• Để các lát cắt thật khô, nhỏ vài giọt hỗn hợp 2 màu lục iod và đỏ son phèn,
để nhuộm từ 5 – 10 phút.
• Rửa kỹ bằng nước cất đến khi nào thấy nước rửa không còn màu của thuốc nhuộm nữa thì được.
- Quan sát và chụp hình dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 4x, 10x, 40x, soi trong dung dịch glycerin 30 %. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2. Khảo sát độ tinh khiết 2.2.2.1. Xác định độẩm 2.2.2.1. Xác định độẩm
Nguyên tắc
- Cất dược liệu với một dung môi không đồng tan với nước nhưng tạo với nước thành một hỗn hợp có điểm sôi nhất định (hỗn hợp đẳng phí). Tại điểm sôi này nước và dung môi đều bốc hơi. Khi gặp lạnh ở ống sinh hàn, hơi nước và hơi dung môi ngưng tụ lại rơi xuống ống hứng, nước tách ra khỏi dung môi. Nước nặng hơn
dung môi nên chìm xuống phần dưới của ống đo nước. Cất đến khi thể tích của nước không đổi. Đọc thể tích nước. Tính kết quả [3], [6].
- Dung môi thường dùng là: Toluen (điểm sôi 112 0C), xylen (hỗn hợp của 3
đồng phân có khoảng sôi 136 – 140 0C) hay benzen (điểm sôi 80 0C). Tiến hành
- Dụng cụ
Bao gồm: Bình cầu 500 ml, bộ phận xác định lượng nước (bầu ngưng tụ,
ống dẫn hơi, và ống hứng chia vạch), ống sinh hàn và nguồn nhiệt (sử dụng bếp
điện).
- Cách tiến hành
Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước rồi làm khô. Thêm 200 ml toluen và khoảng 2 ml nước vào bình cầu khô. Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút rồi đọc thể tích nước cất được ởống hứng (V1), chính xác đến 0,05 ml.
Thêm vào bình cầu một lượng mẫu thử đã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2 - 3 ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Ðun nóng nhẹ trong 15 phút, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt dịch cất trong 1 giây. Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ
cất lên 4 giọt dịch cất trong 1 giây. Tiếp tục cất cho đến khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa.
Dùng 5 - 10 ml toluen rửa thành trong ống sinh hàn. Cất thêm 5 phút nữa. Tách bộ phận cất ra khỏi nguồn cấp nhiệt, để cho ống hứng nguội đến nhiệt
độ phòng. Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2).
Các mẫu đều được tiến hành lặp lại 3 lần .
Ðộẩm (x %) của dược liệu được tính theo công thức sau:
x% = x% = x% =
100 x (V2 – V1) p
Trong đó: V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: Số ml nước cất được sau lần cất thứ hai p: Số g mẫu đã cân đem thử
Đánh giá kết quả
Dược liệu đạt yêu cầu khi độẩm không quá 14%.
2.2.2.2. Xác định độ tro a. Tro toàn phần a. Tro toàn phần Nguyên tắc
Tro toàn phần là cắn còn lại khi ta đốt cháy hoàn toàn một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxyd [3], [6].
Tiến hành
Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén.