Kết quả của quy trình phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật cho biết các nhóm hợp chất có mặt trong dược liệu. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, các phản ứng định tính của quy trình phân tích sơ bộ không cho phép kết luận một cách chắc chắn sự có mặt hay vắng mặt của một nhóm hợp chất trong nguyên liệu. Vì vậy, các nhóm hợp chất này tiếp tục được định tính bằng phản ứng hóa học và SKLM [5], [9].
a. Định tính bằng phản ứng hóa học
Sau khi định tính sơ bộ, tiến hành xác định từng hợp chất đã phát hiện trong dược liệu bằng cách chiết xuất trực tiếp từ dược liệu rồi xác định bằng các phản ứng
đặc trưng.
9 Định tính coumarin
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 20 ml EtOH 96%, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút, sau đó lọc dịch lọc qua giấy lọc. Lặp lại khoảng 2 lần nữa cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc, cô còn khoảng 10 ml làm các phản
ứng định tính.
Phản ứng đóng mở vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau, mỗi ống 2 ml dịch lọc. - Ống 1: Thêm 4 ml nước cất, dung dịch trở nên đục. - Ống 2: Thêm 6 giọt NaOH 10%.
Đun cách thủy ống 2 trong 2 - 3 phút. Để nguội, thêm vào 4 ml nước cất. Ống 2 sẽ trong hơn ống 1. Acid hóa ống 2 với vài giọt HCl đậm đặc (thử bằng giấy pH) thì dung dịch sẽđục nhưống 1.
Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV
Nhỏ một giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc, chờ khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần nữa. Nhỏ chồng lên đó 1 giọt NaOH 5% sấy khô. Che ½ vết bằng 1 miếng kim loại
rồi đem soi dưới đèn UV365 nm trong vài phút. Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nửa không bị che sáng hơn nửa bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia UV thì sau vài phút thì cường độ
phát quang của 2 bên sẽ sáng như nhau. 9 Định tính glycosid tim
Chiết xuất
Lấy 5 g bột dược liệu ngâm trong một bình nón 100 ml với 30 ml cồn EtOH 25% trong 24 giờ. Sau đó chiết siêu âm nóng khoảng 10 - 15 phút. Gạn hay lọc dịch lọc vào 1 bécher.
Phần bã còn lại được chiết tiếp bằng siêu âm nóng như trên thêm 2 lần nữa, mỗi lần với 15 ml cồn EtOH 25%. Gộp chung các dịch lọc.
Thêm vào dịch chiết 6 ml dung dịch chì acetat 30 %, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc qua giấy lọc. Kiểm tra việc loại tạp bằng cách nhỏ vào dịch lọc 1 giọt dung dịch chì acetat, nếu còn xuất hiện tủa thì phải cho thêm dung dịch chì acetat và lọc lại.
Thêm vào dịch lọc trên 6 ml dung dịch natri sulfat 15%, khuấy kỹ, để lắng rồi gạn và lọc lại qua giấy lọc (Kiểm tra việc loại chì acetat thừa bằng 1 giọt natrisulfat).
Dịch lọc sau khi đã loại hết muối chì thừa được lắc với chloroform (10 ml x 2 lần) trong một bình lắng gạn. Gộp chung các dịch chloroform và làm khan bằng Na2SO4 khan.
Xác định phần aglycon
• Xác định khung steroid – Phản ứng Lieberman – Burchard
Cho 1 ml anhydrid acetic vào ống nghiệm có chứa 2 ml dung dịch glycosid tim trong CHCl3, lắc đều. Cho cẩn thận theo thành ống nghiệm hoặc sát xuống đáy ống nghiệm (tránh làm xáo động dung dịch) khoảng 1 ml acid sulfuric đậm đặc. Giữa 2 lớp TT sẽ xuất hiện 1 vòng ngăn cách, phía dưới có màu hồng, phía trên có màu xanh lá tới xanh chàm.
• Xác định vòng lacton 5 cạnh
Phản ứng với thuốc thử Raymond – Marthoud
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Cho vào ống nghiệm có chứa cắn vài giọt TT m - dinitrobezen 1 % trong cồn tuyệt đối, khuấy đều rồi thêm 1 - 2 giọt NaOH 10 % trong cồn, sẽ xuất hiện màu tím không bền. Phản ứng này cũng có thể thực hiện trên giấy lọc hay trên chén sứ.
Phản ứng với TT Kedde
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Hòa cắn với 1 ml cồn EtOH 50 %, sau đó thêm vào 0,4 ml dung dịch 2 % của acid 3,5 - dinitrobenzoic và 0,4 ml dung dịch NaOH 2 %. Dung dịch glycosid tim sẽ có màu tím đỏ.
Xác định phần đường 2 - desoxy
Phản ứng với acid phosphoric đậm đặc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bốc hơi tới cắn khoảng 10 ml dịch chiết glycosid tim. Hòa cắn vào 1 ml aceton, thêm 5 ml acid phosphoric đậm đặc (d = 1,7), lắc đều rồi đặt trên bếp cách thủy trong 15 phút sau đó làm nguội. Các hợp chất có đường 2 - desoxy cho màu vàng.
9 Định tính flavonoid
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 100 ml. Thêm 25 ml EtOH 95% vào bình.
Đậy nút bông và chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm
- Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% - Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1%
- Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính Thực hiện
Phản ứng của vòng γ- pyron
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm một ít bột Mg kim loại rồi thêm từ từ
2 – 3 ml HCl đậm đặc. Quan sát sự chuyển màu của dung dịch. Phản ứng của nhóm anthocyanin
Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Ống thứ 1 thêm 1 giọt HCl 1%,
ống thứ 2 thêm 1 giọt NaOH 1%, ống thứ 3 để nguyên. Quan sát màu của 3 ống nghiệm.
Phản ứng của nhóm leuco - anthocyanidin
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết trong cồn và 5 giọt HCl đậm đặc. Đun cách thủy trong vòng vài phút, lắc đều. Quan sát màu của dung dịch, so với ống chứng.
9 Định tính tannin
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml nước, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút (nếu dung dịch có nhiều hợp chất polyuronid thì dùng hỗn hợp cồn - nước hay aceton - nước để chiết). Lọc lấy dịch lọc trong. Chiết lặp lại như trên khoảng 2 lần nữa, cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc, cô lại còn khoảng 10 ml, dùng làm các phản ứng định tính.
Định tính chung tanin từ dược liệu – phản ứng với protein
Lấy vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, cho vào vài giọt gelatin muối (dung dịch 1% gelatin trong nước muối 9%). Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục.
Định tính phân biệt 2 loại tannin
Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch chiết nước. Thêm lần lượt các thuốc thử:
- Ống 1: Làm ống đối chứng - Ống 2: 1 giọt TT FeCl3 1%
Quan sát sự tạo màu, tạo tủa của dung dịch để kết luận loại tannin.
Bảng 2.2: Thuốc thử dùng phân biệt 2 loại tannin
Thuốc thử Tannin pyrogallic Tannin pyrocacechic
FeCl3 1% Xanh đen Xanh rêu
Stiasny + đun cách thủy 10 phút Không tủa Tủa vón cục đỏ gạch 9 Định tính triterpenoid
Chiết xuất
Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 30 ml cồn EtOH 96%, chiết siêu âm nóng khoảng 30 phút. Lọc lấy dịch lọc trong. Chiết lặp lại như trên khoảng 2 lần nữa, cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp các dịch lọc cô tới cắn, dùng làm phản
ứng định tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng Liebermann - Burchard
Hòa cắn trên với 1 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 1 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển sang màu xanh lục hay tím.
9 Định tính hợp chất polyuronid
Nhỏ từng giọt một 2ml dịch chiết nước vào 1 ống nghiệm chứa 10 ml EtOH 95% (hoặc aceton). Các hợp chất polyuronid sẽ cho tủa bông có từ trắng tới vàng nâu.
Xác định chất nhầy: Nếu có tủa bông được tạo thành ở phản ứng trên, lọc hoặc ly tâm lấy tủa. Rửa tủa bằng cồn EtOH 95%. Tủa được nhuộm với dung dịch xanh methylen, xanh toluidin hay hematoxylin. Tủa nhầy sẽ cho màu tím hay xanh dương.
Lựa chọn dung môi chiết xuất và hệ dung môi khai triển thích hợp, tiến hành SKLM để kiểm tra và định tính các nhóm hợp chất đã được khẳng định là có đối với
định tính bằng phản ứng hóa học [1], [4], [9], [26]. 9 Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký
Dịch chiết cồn EtOH 96% của dược liệu được bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn. Hòa cắn với CHCl3, dùng dung dịch này làm dịch chấm sắc ký.
Hệ dung môi sắc ký
Benzen - Ethyl acetat (9 : 1) Bản mỏng chấm sắc ký
Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Đức) Cách phát hiện vết
Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại với λ = 365 nm, các vết cho màu xanh dương, xanh dương – xanh lá cây, vàng, nâu,….
Phun dung dịch KOH 10% trong EtOH 96%, sấy ở 105 0C khoảng 5 phút, sau
đó soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại với λ = 365 nm, vết coumarin phát quang màu xanh dương.
9 Định tính hợp chất polyphenol
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký
Dịch chiết cồn EtOH 25% được bốc hơi trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa lại cắn vào nước. Lắc dịch nước với ethyl acetat trong bình lắng 250 ml, lắc đến khi lớp ethyl acetat hóa trong (lắc khoảng 3 lần). Lấy lớp trên đem cô tới cắn. Sau đó, hòa lại cắn trong methanol. Dùng dịch này chấm sắc ký.
Bản mỏng chấm sắc ký
Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Đức) Hệ dung môi sắc ký
Cách phát hiện vết
Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại với λ = 254 nm , các vết chất tắt quang. Phun FeCl 5% trong EtOH 96%, vết chất có màu xanh rêu hoặc xanh đen. Xông hơi dung dịch NH3đậm đặc, vết chất có màu vàng.