a. Tinh dầu
Dịch chấm
Tinh dầu của 3 mẫu lần lượt được hòa trong n – hexan làm dịch chấm.
Bản mỏng chấm sắc ký Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Đức) Hệ dung môi Benzen - Ethylacetat (9 : 1) Toluen - Ethylacetat (15 : 5) Cách phát hiện
Quan sát các vết tắt quang dưới đèn tử ngoại với λ = 254 nm Quan sát các vết phát quang dưới đèn tử ngoại với λ = 365 nm
Phun TT vanilin 1% trong EtOH 96%, sấy bản mỏng ở 100 – 105 0C trong 5 phút.
Dịch chấm
Lọc nước no tinh dầu trong bình chưng cất tinh dầu. Lấy dịch lọc lắc với n - hexan. Cô giảm áp tới cắn. Lấy cắn hòa trong n - hexan làm dịch chấm.
Hệ dung môi
Benzen - Ethylacetat (9 : 1)
Cách phát hiện
Quan sát các vết tắt quang dưới đèn tử ngoại với λ = 254 nm. Quan sát các vết phát quang dưới đèn tử ngoại với λ = 365 nm.
Phun TT vanilin 1% trong EtOH 96%, sấy bản mỏng ở 100 – 105 0C trong 5 phút.
2.2.4.4. Định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)
Tinh dầu 3 mẫu thử lần lượt được xác định thành phần hóa học trên sắc ký ghép khối phổ (GC - MS). Chương trình nhiệt và các thông số thực nghiệm được điều chỉnh trên GC, các thông số này được tối ưu hóa và áp dụng trên GC – MS [10].
- Cửa tiêm mẫu (injection port): một microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽđược tiêm vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000 oC để mẫu trở thành dạng khí.
- Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 400 oC cho tới 3200 oC.
- Cột (column): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. Ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc.
Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụđếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là khối phổ.
Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc. Máy tính sẽ chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.
2.2.5. Phương pháp chiết xuất dược liệu 2.2.5.1. Chiết cao tổng cồn 96 % 2.2.5.1. Chiết cao tổng cồn 96 % Nguyên tắc
Sử dụng phương pháp ngấm kiệt để chiết mẫu, với dung môi chiết là cồn 96 %. Nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan vào nhau”, do đó có thể chiết
được tất cả các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu trong nguyên liệu [9].
Cách tiến hành
Cân 100 g bột nguyên liệu, bột được làm ẩm bằng cồn 96%. Cho mẫu vào bình ngấm đã lót bông ở đáy, sau đó phủ lên trên nguyên liệu một lớp giấy lọc. Cho từ từ
cồn vào bình, đổ ngập dung môi cách mặt dược liệu khoảng 5 – 6 cm, ngâm qua đêm. Sau 24 giờ mở vòi, rút dịch chiết ra. Tiếp tục châm cồn vào và ngâm 24 giờ tiếp theo, chiết cho đến khi dịch chiết gần như không màu. Gộp tất cả dịch chiết lại đem cô giảm áp cho đến khi bay hết cồn ta thu được cao tổng cồn 96%.
2.2.5.2. Chiết cao tổng cồn 45%
Nguyên tắc: Giống như phần chiết cao tổng cồn 96%.
Cách tiến hành: Giống như phần chiết cao tổng cồn 96%, chỉ thay cồn 96% bằng cồn 45%.
2.2.6. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 2.2.6.1. Xác định năng lực khử 2.2.6.1. Xác định năng lực khử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Năng lực khử của các mẫu cao được xác định bằng phương pháp của Yen và Duh (1993) [14], [31].
Nguyên tắc
Nguyên tắc chung là năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử
khi tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó, khi xác định được năng lực khử ta cũng xác định được khả năng chống oxy hóa của một chất.
Trong phương pháp của Yen và Duh (1993), chất khử (chất thử nghiệm) sẽ khử
potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Như
vậy trong quá trình phản ứng, ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử
thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid. Phương trình phản ứng:
X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] Hay X + [Fe(CN)6]3- [Fe(CN)6]4-
Sau đó bổ sung Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanid có màu xanh phổ (Prussian Blue) có công thức Fe4[Fe(CN)6]3. Đo độ hấp thụ màu ở 700 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid [Fe(CN)6]4- được tạo thành, tức là tỉ lệ với khả năng khử của hợp chất thử nghiệm. 4 Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4- Fe4[Fe(CN)6]3
(Màu xanh phổ)
Tiến hành thí nghiệm
Quy trình khảo sát năng lực khửđược tiến hành theo thứ tự như bảng 2.3 sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 0 200 400 600 800 1000 Mẫu thử nghiệm 1 1 1 1 1 1
Đệm phosphat (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 K3[Fe(CN)6] (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Ủở 50 0C trong 20 phút Acid tricloroacetic 5% (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Lọc/ly tâm. Lấy 1 ml dịch lọc Nước cất (ml) 2 2 2 2 2 2 FeCl3 1% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Đo độ hấp thu ở 700 nm
Độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 700 nm càng cao thể hiện năng lực khử càng cao.
2.2.6.2. Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do
Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử được xác định theo phương pháp của Wang (1994) [17], [27], [28].
Nguyên tắc
Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định dựa trên nguyên tắc của phản
ứng Fenton. Phản ứng Fenton là phản ứng giữa hydroperoxid (H2O2) với ion Fe2+. H2O2 sẽ gây oxy hóa ion Fe2+ để tạo thành ion Fe3+, một gốc hydroxyl tự do (OH) và một ion hydroxyl (OH-).
Phương trình phản ứng:
Các chất có hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do sẽ phân hủy các gốc hydroxyl mới sinh ra từ phản ứng trên. Hàm lượng gốc hydroxyl còn lại càng nhiều sẽ làm giảm cường độ màu của thuốc thử Safranin-O. Cường độ màu của thuốc thử Safranin-O sẽ tỉ
lệ với hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do.
Tiến hành thí nghiệm
Pha các mẫu cao chiết và chất kháng oxy hóa đã biết (vitamin C, BHA, BHT) thành các nồng độ khác nhau từ 200 µg/ml đến 1000 µg/ml. Hút 1ml chất thử nghiệm vào ống nghiệm.
Thứ tự tiến hành thí nghiệm như trong bảng 2.4 sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 0 200 400 600 800 1000 Đệm sodium phosphat 0,15M pH 7,4 (ml) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 EDTA- Fe2+ 2nm (ml) 1 1 1 1 1 1 Safranin- O 0,036% (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 H2O2 3% (ml) 1 1 1 1 1 1
Ủở 37 0C trong thời gian 30 phút
Đo độ hấp thu ở 520 nm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu quả kháng gốc hydroxyl tự do của các mẫu thí nghiệm được tính bằng công thức:
Trong đó:
Amẫu : Độ hấp thu của mẫu thử nghiệm ở bước sóng 520 nm. Athử không : Độ hấp thu của mẫu thử không ở bước sóng 520 nm. Ađối chứng : Độ hấp thu của mẫu đối chứng ở bước sóng 520 nm.
Mẫu thử không: Là mẫu mà trong đó chất thử nghiệm được thay bằng nước cất. Mẫu đối chứng: Là mẫu mà trong đó H2O2 được thay bằng nước cất.
2.2.6.3. Thử nghiệm DPPH
Hoạt tính kháng gốc DPPH tự do của các mẫu thử được xác định theo phương pháp của Shimada, Fujikawa, Yahara và Nakamura (1992), có chỉnh sửa cho phù hợp [22], [23], [32].
Nguyên tắc
Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có độ hấp thu cực đại là λmax= 515 nm.
DPPH là gốc tự do, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi. Sự làm giảm màu tím đặc trưng của DPPH là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử
H của chất nghiên cứu (có tác dụng chống oxy hóa) để tạo thành DPPH dạng nguyên tử.
Hiệu quả kháng OH (%) =
Amẫu - Athử không
Cách tiến hành
Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,6 mM trong methanol. Dung dịch này không bền nên chỉ có thể dùng trong vòng 24 giờ sau khi pha.
Pha các mẫu cao chiết và chất kháng oxy hóa đã biết thành các nồng độ khác nhau. Hút 0,5 ml chất thử nghiệm vào ống nghiệm.
Thứ tự tiến hành thí nghiệm như trong bảng 2.5 sau:
Mẫu Mẫu chứng Mẫu thử Nồng độ (µg/ml) 0 Nồng độ thích hợp Dịch thử (ml) 0 0,5 MeOH (ml) 3,5 3 Dung dịch DPPH 0,6 mM (ml) 0,5 0,5
Ủ trong tối, ở nhiệt độ thường trong 30 phút
Đo độ hấp thu ở 515 nm
Công thức tính phần trăm (%) hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) HTCO(%) = − ×100 C T C OD OD OD Trong đó:
ODC : Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH ODT : Mật độ quang của dung dịch DPPH và mẫu thử
Dựa vào đường chuẩn suy ra IC50
2.2.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 2.2.7.1. Môi trường thử nghiệm 2.2.7.1. Môi trường thử nghiệm
Môi trường giữ giống và thử nghiệm/tăng sinh vi khuẩn TSA (Trypticase Soy Agar)/ TSB (Trypticase Soy Broth), pH 7,3 ± 0,2
Trypticase pepton 15 g Phytone pepton 5 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
Nước cất 1 lít
Đun nóng hòa tan agar, cho vào các ống nghiệm mỗi ống khoảng 10 ml, đem hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút rồi nghiêng thạch.
Chỉnh pH cho phù hợp, cho vào mỗi ống nghiệm 15 ml môi trường, sau đó đem hấp khử trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường nuôi cấy/ tăng sinh nấm SDA (Sabouraud Dextrose Agar) / SDB (Sabouraud Dextrose Broth), pH 5,6 – 6
Pepton 10 g
Dextros 40 g
Agar 17 g
Nước cất 1 lít
Đun nóng hòa tan agar, cho vào mỗi ống nghiệm, đem hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút rồi nghiêng thạch.
2.2.7.2. Phương pháp khuếch tán đĩa Nguyên tắc Nguyên tắc
Dùng khoanh giấy lọc tẩm chất thử nghiệm, đặt lên bản thạch đã trải đều vi khuẩn. Hoạt chất sẽ khuếch tán ra môi trường thạch, nếu có hoạt tính kháng khuẩn sẽ
tạo vòng vô khuẩn. Phương pháp này dùng để xác định chất khảo sát có khả năng kháng khuẩn hay không.
Cách tiến hành
Vi khuẩn: Môi trường TSA được chuẩn bị theo công thức, sau đó được phân vào erlen, đem hấp khử trùng, để nguội khoảng 50 0C rồi đổ đĩa chuẩn bị cho thử hoạt tính.
Nấm: Môi trường SDA được chuẩn bị theo công thức, sau đó được phân vào erlen, đem hấp khử trùng, để nguội khoảng 50 0C rồi đổ đĩa chuẩn bị cho thử hoạt tính.
• Chuẩn bị giống thử nghiệm
Giống vi khuẩn thử nghiệm được hoạt hóa trong môi trường TSB, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 24 giờ. Xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang ở
bước sóng 600 nm và điều chỉnh về mật độ khuẩn trong khoảng là 106 – 107 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi tiến hành điều chỉnh độ đục phải dùng ngay.
Nấm mốc: Được cấy trên môi trường thạch nghiêng SDA, ủ ở nhiệt độ 370C trong 7 ngày.
Nấm men: Được hoạt hóa trong môi trường SDB, ủ ở nhiệt độ 37 0C trong 3 ngày. Xác định mật độ nấm men bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và điều chỉnh về mật độ nấm trong khoảng là 106 – 107 CFU/ml.
• Chuẩn bịđĩa giấy và dung môi hòa tan mẫu
Sử dụng đĩa giấy có đường kính 5mm đã được hấp khử trùng, sau đó sấy khô. Dùng DMSO 100% làm dung môi hòa tan các mẫu cao.
Tetracylin và clotrimazol cũng được hòa tan hoàn toàn trong DMSO 100%.
• Chuẩn bị chất thử nghiệm Thuốc kháng khuẩn: Tetracylin Thuốc kháng nấm: Clotrimazol
Các mẫu cao cồn 96% và 45% hòa tan trong DMSO 100%. Tinh dầu hòa tan trong aceton
Bảng 2.6: Thứ tựđặt đĩa giấy trên các mẫu cao Thứ tựđặt đĩa giấy Chất thử nghiệm Nồng độ 1 Cao TNK dược dụng chiết trong cồn 45% (TNK-DD 45%) 1 mg/ml 2 Cao TNK cuống xanh chiết trong cồn 45% (TNK-Xanh 45%) 1 mg/ml 3 Cao TNK cuống đỏ chiết trong cồn 45% (TNK-Đỏ 45%) 1 mg/ml 4 Cao TNK dược dụng chiết trong cồn 96% (TNK-DD 96%) 1 mg/ml 5 Cao TNK cuống xanh chiết trong cồn 96% (TNK-Xanh 96%) 1 mg/ml 6 Cao TNK cuống đỏ chiết trong cồn 96% (TNK-Đỏ 96%) 1 mg/ml • Trên các mẫu tinh dầu Bảng 2.7: Thứ tựđặt đĩa giấy trên các mẫu tinh dầu Thứ tựđặt đĩa giấy Chất thử nghiệm Nồng độ 1 TNK-DD 2 Chứng âm DMSO
3 TNK-Xanh 4 TNK-Đỏ 5 Chứng dương Tetracylin 1 mg/ml Chứng dương Clotrimazol 1 mg/ml Tiến hành
Dùng pipetman hút 100 µl dịch vi khuẩn, nấm men đã chuẩn bị cho vào đĩa petri chứa môi trường TSA, SDA đã chuẩn bị, sau đó dùng que trải thủy tinh trải đều.
Đối với nấm mốc, thực hiện bằng phương pháp cấy điểm. Tiến hành đặt đĩa giấy.
Dùng pipetman hút 5 µl chất thử nghiệm cho từ từ thấm đều vào đĩa giấy. Thao tác tiến hành đảm bảo điều kiện vô trùng.
Sau đó đem ủở 37 0C. Đối với vi khuẩn ủ trong 1 ngày, nấm men 2 ngày, nấm mốc 7 ngày.
Sau thời gian ủ, khuẩn mọc thành lớp, không tạo nhóm riêng lẻ, căn cứ vào vị trí
đặt đĩa giấy có chất thử nghiệm ta đọc kết quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chất thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm khi tạo vòng kháng trong suốt quanh đĩa giấy và được gọi là đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm. Đối với nấm mốc sẽ là đường kính vòng không tơ.
Tiến hành đo đường kính kháng khuẩn, kháng nấm để xác định mẫu thử nghiệm nào có hoạt tính mạnh nhất.
Kết quảđược ghi nhận bằng hình ảnh và đường kính vòng vô khuẩn.
Đường kính vòng vô khuẩn (ĐKVK) được tính theo công thức:
ĐKVK = VK mẫu thử - VK chứng âm
Kết quả kháng khuẩn được đánh giá dựa trên tỷ lệ của vòng vô khuẩn tính theo công thức RoJas
2.2.8. Phương pháp MIC Nguyên tắc Nguyên tắc
Chất thử nghiệm được pha loãng với dãy nồng độ giảm dần ½. Tại nồng độ thấp nhất không có sự phát triển của khuẩn được xem là nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử nghiệm đối với chủng khuẩn đó.
Cách tiến hành
MIC của mẫu thử được khảo sát bằng phương pháp vi pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng.
Chất thử nghiệm: các mẫu cao chiết và tinh dầu. Chuẩn bị giống thử nghiệm.
Sử dụng phiến vi lượng 96 giếng bán trên thị trường, đã được khử trùng bằng cồn, nhiệt và khử trùng lại bằng đèn UV trong 30 phút để tiến hành khảo sát dãy nồng
độ (MIC) của chất thử nghiệm trên các chủng khuẩn và nấm nhạy cảm với chất thử
nghiệm trong phương pháp khuếch tán.
Dùng pipetman hút cho vào giếng 100 µl môi trường chứa khuẩn ở mật độ
khoảng 106 – 107 CFU/ml.
Lần lượt cho thêm vào từng giếng mẫu thử nghiệm như sau:
• Đối với các mẫu cao chiết: Pha một dung dịch ban đầu với nồng độ 1000 µg/ml, dung môi là DMSO và nước cất.
% VK =
ĐKVK mẫu thử
Bảng 2.8: Quy trình khảo sát MIC của mẫu cao Mẫu thử (µl) Nước cất (µl) Môi trường chứa
khuẩn (µl) Nồng độ mẫu thử trong giếng(µg/ml) 100 0 100 500 50 50 100 250 25 75 100 125 12,5 87,5 100 62,5
• Đối với tinh dầu: Pha một dung dịch ban đầu với nồng độ 5000 µg/ml (với dung môi là aceton), sau đó pha loãng ra với aceton 30% thành các nồng độ
giảm dần.
Bảng 2.9: Quy trình khảo sát MIC của mẫu tinh dầu Mẫu thử (µl) Môi trường chứa khuẩn (µl) Nồng độ mẫu thử trong giếng (µg/ml) 20 180 500 20 180 400 20 180 300 20 180 200
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Vi học
3.1.1. Vi phẫu thân rễ
Bảng 3.10: Cảm quan các mẫu dược liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});