N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
2.3.6.Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh bằng
phương pháp PCR xác định gen nifH.
Sau khi sàng lọc các chủng vi khuẩn trên môi trường giới hạn Nfb vô đạm, và khảo sát khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh. Cũng như những chi tiêu sinh trưởng, tích lũy cholrophyll, N, P...chúng tôi sẽ tuyển chọn các chủng cho phản ứng tốt với các chỉ tiêu trên và tiến hành PCR để xác định sự tồn tại của gen nifH trong các chủng vi khuẩn nội sinh này
Mồi đặc hiệu cho gen nifH cũng như quy trình cho phản ứng PCR được cung cấp và thực hiện tại VCNSH &MT, trường Đại học Tây Nguyên.
Môi xuôi (Pol F) (5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3') Mồi ngược (Pol R) (5' - ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3')
Sản phẩm sau phản ứng được điện di có kích thước 360bp ghi nhận thông qua thang chuẩn 100bp để kết luận.
Nếu xuất hiện vạch có kích thước 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập có mang gen nifH.
Nếu xuất hiện vạch có kích thước khác 360bp thì kết luận vi khuẩn phân lập không mang gen nifH.
Quy trình thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh có mang gen nifH.
Tách chiết tế bào thu nhận DNA
- Thu 1ml sinh khối vi khuẩn, chứng âm vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 5.500v/5 phút. Thu cặn, loại dịch nổi
- Thêm 900μl dung dịch 1, Vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm 200μl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Cẩn thận hút 600μl dịch trong nổi có chứa DNA (tránh làm xáo trộn hai lớp) và một eppendorf khác có chứa sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ có cặn nằm dưới đáy eppendorf. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. - Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ 60°C trong 10 phút. Sau đó, thêm vào 50μl dung dịch 5.
Nếu chưa đặt phản ứng PCR, bảo quản mẫu tách chiết ở -20°C.
Phản ứng PCR
Thành phần phản ứng 25µl bao gồm: 5µl DNA khuôn mẫu, chứng âm, 0.5µl mồi xuôi và ngược (PolF 5' - TGCGAYCCSAARGCBGACTC - 3', PolR 5' -
ATSGCCATCATYTCRCCGGA - 3), 12.5µl PCR mastermix, 7.5µl nước. Chương trình luân nhiệt: 95 – 5 phút 1 chu kỳ
95 – 30 giây
55 – 30 giây 39 chu kỳ 72 – 30 giây
72 – 6 phút 1 chu kỳ
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Thành phần điện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR, chứng âm và 3µl dịch nạp mẫu, 1µl thang 100bp. Cho hỗn hợp vào các giếng trên gel agarose 1%. Điện di ở điện thế 50V trong 5 phút. Sau đó tăng lên 80V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X có ethidium bromide trong 15 phút.
Quan sát kết quả điện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc XR có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad).