3. Ý nghĩa của đề tài
2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh trong
trong rễ cây ngô.
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên nồng độ IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm.
* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA.
- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat ( 200ml) A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7. - Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowski.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA
Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ là 160mg/l. Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy.
Bảng nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 Thể tích IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,25 0,50 1,0 Dung dịch đệm (ml) 2 1,9375 1,875 1,75 1,50 1,0 Tổng thể tích 2 2 2 2 2 2 Nồng độ IAA (mg/l) 0 5 10 20 40 80 Thuốc thử Salkowski 4 4 4 4 4 4 OD530nm
Thực hiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường chiết khoai tây (BMS). Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các chủng vi khuẩn vào
các bình tam giác chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 60h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.