2.2.5.1. Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp. A1 bằng phương pháp truyền thống
Mẫu nước ao thí nghiệm từ đợt thu mẫu thứ 2 của mỗi vụ được sử dụng để tái phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A1. Kiểm tra sự hiện diện của chúng trên môi trường thạch đĩa SCA.
2.2.5.2. Giám sát hoạt động của chế phẩm trợ sinh từ Streptomyces sp. A1 bằng phương pháp phân tử DGGE
Tách chiết DNA
DNA tổng số của vi sinh vật có trong mẫu trầm tích của các ao nghiên cứu được tách bằng PowerSoil®DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sau khi tách chiết, DNA được khuyến cáo là bảo quản ở -20 oC đến -80 oC nhằm ngăn chặn sự biến tính để sử dụng cho các thí nghiệm PCR và điện di sau này.
Khuếch đại vùng V3 của gen 16 S rDNA
Sau khi tách chiết DNA tổng số, vùng V3 của gen 16S rDNA vi khuẩn (177 bp) được khuếch đại bằng PCR với mồi 341F có gắn thêm trình tự giàu GC (40 bp) tại đầu 5’ và mồi 518R. Trình tự như sau:
518R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
Những mồi này đặc hiệu cho vi khuẩn và sản phẩm PCR được sử dụng để đánh giá đa dạng tập đoàn vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu. Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng khuếch đại PCR khoảng 65 oC.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % ở 100 V/30 phút, sau đó được nhuộm với Ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
Điện di DGGE
Kỹ thuật DGGE được tiến hành thực hiện trên thiết bị DcodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-rad, USA) với kích thước bản gel 16 cm × 16 cm. Nồng độ của gel là 10 % polyacrylamide với thang biến tính từ 30-60 % urea. Ammonium persulphate (APS) được thêm đến nồng độ cuối cùng là 0,09 % (w/v) và nồng độ TEMED 0,1 % (v/v) trong gel. Gel được để cho polymer hóa trong khoảng 60 phút.
Tổng số 20 µl sản phẩm PCR được trộn với loading dye và load mẫu vào giếng. Mẫu được đặt vào buồng điện di chứa khoảng 7 L dung dịch đệm 1xTAE và cho chạy hệ thống ở 60 oC trong 17,5 h, hiệu điện thế sử dụng 130 V.
Sau khi điện di được hoàn thành, tắt nguồn điện của hệ thống và lấy gel ra. Đặt gel vào trong một đĩa đựng 250 mL đệm và 25 µl dung dịch 10 mg/ml ethidium bromide (50 µg/ml). Nhuộm trong 5-15 phút. Sau khi nhuộm, cẩn thận chuyển gel vào trong một đĩa chứa 250 mL đệm nhằm loại bỏ thuốc nhuộm trong 5-20 phút. Cuối cùng, đặt gel trên một UV transilluminator và chụp ảnh.
2.2.6. Tạo chế phẩm trợ sinh dạng bột từ Streptomyces sp. A1 với chất mang là bột talcum
Các bước tiến hành cụ thể như sau:
- Nhân giống chủng xạ khuẩn theo phương pháp như đã nêu ở mục 2.2.1 và bảo quản ở 4 oC để sử dụng làm chế phẩm.
- Khử trùng 5 g bột talcum [Mg3(SiO3)3(Si(O))(OH)2] chứa trong các chai kín ở 121 °C/15 phút.
- Để nguội, trộn sinh khối xạ khuẩn vào chất mang theo các mật độ khác nhau (109 và 1010 CFU/g)
- Chế phẩm gồm chất mang và sinh khối xạ khuẩn được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau: 10, 25, 30, 35 oC.
2.2.7. Thăm dò điều kiện bảo quản của chế phẩm
Điều kiện thích hợp cho việc bảo quản chế phẩm gồm sinh khối xạ khuẩn
Streptomyces sp. A1 và bột talcum trong trường hợp này được xác định dựa vào mật độ sống của xạ khuẩn và hoạt tính đối kháng của nó với Vibrio harveyi V7 theo định kỳ 7 ngày/lần.
2.2.7.1. Kiểm tra mật độ sống của Streptomyces sp. A1
Cân 1 g chế phẩm và pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Chọn 1-2 độ pha loãng và cấy trải lên các đĩa petri chứa môi trường SCA và đếm số khuẩn lạc xạ khuẩn hình thành sau 3 ngày nuôi cấy ở 35 oC.
Mật độ tế bào trong mẫu ban đầu được tính theo công thức sau:
A =
Trong đó:
A: số tế bào/g hay mL
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng
2.2.7.2. Kiểm tra hoạt tính đối kháng với Vibrio harveyi V7 của chế phẩm từ Streptomyces sp. A1
Hoạt tính đối kháng với Vibrio harveyi V7 của chế phẩm trợ sinh từ
Streptomyces sp. A1 được xác định bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp, tiến hành như sau:
- Cấy vạch xạ khuẩn lên các đĩa petri chứa môi trường SCA từ các khuẩn lạc riêng biệt thu được ở mục 2.2.7.1 đã trình bày ở trên. Bao gói các đĩa và nuôi ở tủ ấm 35 oC.
- Sau 3 ngày, đổ một lớp mỏng môi trường TCBS lên các đĩa này để tạo lớp thạch thứ 2.
N
- Cấy trải 100 µL dịch huyền phù Vibrio harveyi V7 đã được tăng sinh 24 h trong môi trường peptone kiềm lên lớp thạch thứ 2.
- Đặt các đĩa petri ở 4 oC trong vòng 10-12 h sau đó chuyển các đĩa vào tủ ấm nuôi ở 35 oC trong vòng 24 h.
- Quan sát sự hình thành vòng phân giải
