Kỹ thuật DGGE được sử dụng cho nhiều mục đích trong lĩnh vực sinh thái VSV. Ứng dụng đầu tiên và phổ biến nhất là phát hiện và so sánh mức độ đa dạng của quần thể VSV trong các môi trường khác nhau. Ngoài ra, các nhà khoa học cũng ứng dụng kỹ thuật này để phân tích sự biến động trong cấu trúc quần thể VSV theo thời gian [97].
Muyzer và cs. (1993) đã sử dụng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể VSV trong môi trường. Qua nghiên cứu này, các tác giả đã tìm ra chủng vi khuẩn khử sulfate kị khí mà không phát triển khi nuôi trong điều kiện hiếu khí. Năm 1994, Muyzer cùng với De Wall đã tiếp tục nghiên cứu và cải tiến kỹ thuật này, hai ông đã cắt các băng DNA sau điện di DGGE ra khỏi gel và đem đi phân tích trình tự [21]. Từ đó, kỹ thuật DGGE ngày càng hoàn thiện hơn và trở thành một quy trình chuẩn để nghiên cứu đa dạng VSV.
Zhang và cs. (2009) đã nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn và mối quan hệ giữa các biến động của môi trường đến quần thể này trong các mẫu trầm tích thu được từ các hệ sinh thái rừng ngập mặn nhiệt đới ở Tam Á thuộc đảo Hải Nam, Trung Quốc. Dữ liệu về quần thể vi khuẩn ở nơi đây được tạo ra nhờ nuôi cấy, PCR-DGGE và kết quả thống kê cho thấy sự đa dạng trong thành phần loài ở các địa điểm và thời gian thu mẫu khác nhau. Người ta cũng nhận thấy nồng độ carbon hữu cơ trong mẫu trầm tích ảnh hưởng đáng kể đến sự biến động trong thành phần các loài ưu thế. Kết quả giải trình tự 17 băng dại diện sau DGGE và so sánh trên BLAST đã xác định các loài vi khuẩn chiếm ưu thế với các nhóm phân loại khác nhau, có thể kể đến như Proteobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes,
Yamamoto và cs. (2009) đã đánh giá sự biến động của hệ VSV trong suốt quá trình ủ phân động vật (composting) từ 3 nguồn khác nhau (nguồn A, B, C) bằng kỹ thuật PCR-DGGE. Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự thay đổi trong cấu trúc quần thể vi khuẩn trong quá trình composting. Mẫu phân từ nguồn A có sự biến động nhỏ thành phần loài VSV, và ở mẫu B chỉ cho thấy có sự biến đổi khi có sự gia tăng nhiệt độ. Trong khi đó, các mẫu từ nguồn C có sự đa dạng trong quần thể vi khuẩn theo các khoảng nhiệt độ khác nhau. Trong pha đầu tiên của quá trình composting, chiếm ưu thế hơn cả là các loài Bacteroidetes; trong giai đoạn ưa nhiệt, một số vi khuẩn thuộc nhóm Firmicutes có xu hướng gia tăng, và ở giai đoạn cuối cùng quần thể vi khuẩn bao gồm Bacteroidetes, Firmicutes và Proteobacteria [84].
Ye và cs. (2011) đã đánh giá sự biến động theo thời gian của quần thể vi khuẩn cyanobacteria trong mẫu nước và trầm tích của hồ Taihu, ở tỉnh Hồ Châu, Trung Quốc bằng kỹ thuật DGGE và real-time PCR. Kết quả cho thấy sự đa dạng khá thấp trong các mẫu nước thu nhận được và 2 loài chiếm ưu thế là Microcystis
và Synechococcus. Vào mùa nở hoa nước (tháng 6-9), số lượng của Synechococcus
trong mẫu thường cao hơn nhiều so với Microcystis và tỉ lệ này là ngược lại trong tháng 12. Tương tự, đối với mẫu trầm tích, sự biến động của các loài cyanobacteria lớn nhất ghi nhận được từ các mẫu trầm tích ở độ sâu 20-25 cm [102].
Vũ Nguyên Thành và Lê Đức Mạnh (2006) tiến hành đánh giá hệ VSV trong bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải UASB bằng kỹ thuật DGGE. Phần lớn VSV trong bể UASB là những loài kỵ khí, tham gia vào mối tương tác cộng sinh phức tạp và khó có thể phân lập được trên môi trường dinh dưỡng. Các tác giả đã kết hợp giữa kỹ thuật DGGE cùng với phân tích trình tự để xác định thành phần hệ VSV chủ yếu trong bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải nhà máy Sữa Hà Nội. Nhóm VSV kỵ khí trong bùn cấu thành từ các loài sinh acid, hydrogen và methane. Kết quả phân tích cho thấy có hai loài sinh methane được phát hiện, đó là hai loài vi khuẩn cổ Methanomethylovorans hollandica và Methanothrix soehngenii. M. soehngenii là loài chủ đạo khi quá trình xử lý kỵ khí đã ổn định và có thể được sử dụng làm loài VSV chỉ thị của hệ thống [31].
Trong một nghiên cứu khác, Lê Đức Mạnh và cs. (2006) cũng đã sử dụng kỹ thuật DGGE để đánh giá động học hệ sinh thái bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải của nhà máy sản xuất bia. Kết quả phân tích DGGE sản phẩm khuếch đại 16S rDNA cho vi khuẩn và cổ khuẩn trong bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải bia rất đa dạng. Đánh giá sơ bộ cho thấy có đến vài chục loài VSV trong hệ sinh thái. Sau đó, nhóm tác giả đã tiến hành cắt một số băng đại diện, khuếch đại lần nữa, tinh sạch và giải trình tự DNA để xác định loài. Kết quả cho thấy một trong những VSV phổ biến và quan trọng là các loài thuộc chi Veillonella. VSV sinh methane xuất hiện trong giai đoạn sau với số lượng tăng dần, nhưng giảm dần sự đa dạng. Như vậy, kỹ thuật DGGE kết hợp với giải trình tự, phân tích dữ liệu và quan sát dựa trên hình thái có thể giúp ích cho việc đánh giá thực trạng của hệ sinh thái [20].
Nguyễn Bá Hữu và cs. (2007) đã xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử chlor Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn này hiện diện ở tất cả các mẫu bùn từ các hồ bị ô nhiễm được nghiên cứu [12]. Năm 2008, nhóm nghiên cứu lại tiếp tục đánh giá đa dạng vi khuẩn trong các hồ nhiễm dioxin ở trên cũng bằng kỹ thuật DGGE. Kết quả của nghiên cứu này đã giúp ích trong việc đưa ra phương pháp xử lý ô nhiễm chất độc dioxin ở miền trung Việt Nam bằng con đường phân hủy sinh học [14].
Phạm Thị Tuyết Ngân và cs. (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung dầu thực vật lên sự đa dạng quần thể VSV trong bể lọc sinh học bằng kỹ thuật DGGE để. Mục đích của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của dầu thực vật lên quá trình nitrate hóa và phản nitrate hóa trong hai hệ thống lọc tuần hoàn nước mặn và nước lợ [23].
Nguyễn Thị Tuyền và cs. (2009) đã sử dụng kỹ thuật RFLP và PCR-DGGE để đánh giá đa dạng vi khuẩn khử nitrate trong một số môi trường sinh thái ở Việt Nam và tìm ra các chủng đại diện cho nhóm vi khuẩn này. Đầu tiên, tác giả đã tiến hành RFLP gen 16S rDNA sử dụng hai enzyme HaeIII và MspI. Sau đó phân tích
thành phần loài trong quần thể VSV bằng điện di biến tính và PCR trực tiếp từ các băng cắt ra từ gel DGGE, tinh sạch các băng này để đọc trình tự tìm ra các chủng vi khuẩn đại diện [35].
Thái Mạnh Hùng và cs. (2011) đã nghiên cứu động học của quá trình tạo biogas và quần thể methanogen trong bể lên men kỵ khí ở nhiệt độ cao xử lý kết hợp bùn thải và rác hữu cơ. Nhóm tác giả đã sử dụng PCR-DGGE gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu đối với cổ khuẩn 0348aF và 0691R. Sau khi tiến hành PCR và điện di trên gel biến tính, các băng chính được cắt, thôi gel trong nước, khuếch đại, tinh sạch, phân tích trình tự. Trình tự gen thu được sau đó được đem phân tích và so sánh với trình tự 16S rRNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank nhờ công cụ BLAST [11].
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A1 có khả năng trợ sinh trong nuôi tôm được được nhóm chúng tôi phân lập và đặc tính hóa trước đây [81]. Mẫu hiện đang được lưu giữ ở trạng thái đông khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
- Mẫu nước và mẫu trầm tích các ao nuôi tôm ở Phú Lộc – TT Huế.
Hình 2.1. Hình thái khuẩn lạc Streptomyces sp. A1 trên môi trường thạch-casein-tinh bột.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A1
2.2.1.1. Nhân giống cấp 1 trong các bình ở điều kiện lắc
- Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A1 được nuôi cấy trên môi trường thạch- tinh bột-casein (SCA). Sinh khối được hòa trong dung dịch nước muối sinh lý (0,85 % NaCl) đến một mật độ thích hợp và được sử dụng để làm dịch cấy.
- Nhân giống chủng xạ khuẩn trong các bình tam giác chứa 150 mL môi trường tinh bột-casein dịch thể (SCB); điều chỉnh pH môi trường đến 8,0.
- Cấy dịch cấy vào môi trường với thể tích sao cho mật độ cuối cùng đạt 108
tế bào/mL.
- Nuôi cấy các bình tam giác trên máy lắc ổn nhiệt (Jeiotech SI-600R, Korea) ở 30 oC, 150 vòng/phút.
2.2.1.2. Nhân giống cấp 2
- Chuẩn bị 5 L môi trường tinh bột-casein dịch thể (SCB) đã được tối ưu hóa [1] và cho vào bình lên men 10 L (Infors Labfors HT, Switzerland), khử trùng môi trường ở 121 oC/15 phút, để nguội.
- Với tỷ lệ tiếp giống là 1:10 (v/v) từ giống cấp 1, giống xạ khuẩn được nhân trong bình lên men với các thông số vận hành như sau: pH 8,0, nhiệt độ 30 oC, tốc độ khuấy 150 vòng/phút.
Hình 2.2. Hệ lên men 10 L (Infors Labfors HT, Switzerland )
2.2.1.3. Tạo chế phẩm xạ khuẩn dạng thô
Sau 3 ngày nhân giống theo các phương pháp nêu trên, tiến hành thu sinh khối xạ khuẩn bằng cách lọc chân không. Sinh khối thu được sau đó được xử lý bằng cách đặt vào tủ ấm 35 oC trong 6 h nhằm loại bớt nước và bảo quản ở 4 oC.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Tôm sú (Penaeus monodon) được nuôi tại các ao ở hồ cao triều, khu vực 4, thị trấn Phú Lộc, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế (tọa độ: 16o16’20.39’’N & 107o52’29.77’’E) theo kinh nghiệm của các hộ nuôi tôm tại địa phương.
Thí nghiệm của chúng tôi được chia làm 2 lần khảo sát riêng biệt tương ứng với 2 vụ tôm khác nhau: vụ 1 kéo dài từ 23/02 đến 17/05/2012 bao gồm 7 đợt thu mẫu; vụ 2 từ 28/06 đến 06/09/2012 tương ứng với 6 đợt thu mẫu.
Hình 2.3. Hình ảnh ao nuôi thí nghiệm (trái) và ao nuôi đối chứng (phải) tại thị trấn Phú Lộc, huyện Phú Lộc, tỉnh TT Huế.
Ở vụ 1, ấu trùng tôm sú (PL) 9 ngày tuổi được cung cấp bởi các trại giống trên địa bàn Đà Nẵng được thả vào các ao nuôi diện tích 1000 m2 với mật độ thả nuôi là 30 con/m2. Tôm được cho ăn thức ăn thương mại với khối lượng bằng 1% trọng lượng cơ thể, chia làm ba lần mỗi ngày. Các ao nuôi không có sự trao đổi nước liên tục với bên ngoài mà chỉ thêm nước vào khi mực nước trong ao hạ thấp. Ở ao thí nghiệm (TN), chế phẩm trợ sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A1 được bổ sung trực tiếp vào nước nuôi với mật độ 105 CFU/L định kỳ 2 tuần/lần (tính từ thời điểm bổ sung chế phẩm) và ao đối chứng (ĐC) không bổ sung chế phẩm. Ngoài ra, còn có một ao so sánh (SS) được bổ sung chế phẩm thương mại.
Ở vụ 2, thí nghiệm cũng được bố trí như trên nhưng chỉ tiến hành bổ sung chế phẩm từ xạ khuẩn Streptomyces sp. A1 khi ấu trùng tôm sú được ương sau 1 tháng tuổi. Do điều kiện thí nghiệm không cho phép nên chỉ khảo sát được trên một ao TN và một ao ĐC không bổ sung chế phẩm. Ở ao TN, chế phẩm từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. A1 được bổ sung trực tiếp vào nước nuôi với mật độ 105 CFU/L, định kỳ 10 ngày/lần (tính từ thời điểm bổ sung chế phẩm).
2.2.3. Thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu nước được lấy định kỳ 2 tuần/lần (tính từ thời điểm bổ sung chế phẩm) theo phương pháp tổ hợp các điểm ngẫu nhiên ở độ sâu 20 cm so với mặt nước ao nuôi và được bảo quản lạnh trong các chai nhựa sạch. Đối với mẫu trầm tích thì tiến hành thu mẫu ở độ sâu 0-10 cm ở tầng bề mặt của nền đáy ao nuôi. Một số thông số chất lượng nước được đo tại hiện trường, các thông số còn lại được phân tích trong phòng thí nghiệm.
2.2.4. Phân tích chất lượng nước môi trường ao nuôi tôm
2.2.4.1. Các thông số đo tại hiện trường
Các thông số nhiệt độ, độ dẫn điện, độ đục, độ mặn, pH, oxygen hòa tan (DO) và tổng chất rắn hòa tan (TDS) được đo tại hiện trường bằng máy Horiba U-52 (Japan)
2.2.4.2. Tổng lượng chất rắn (TSS) xác định theo phương pháp khối lượng[40]
Nguyên tắc
Lọc mẫu (đồng nhất) qua giấy lọc tiêu chuẩn đã cân trước và sấy khô phần nằm lại trên giấy lọc ở 103-105 oC. Phần gia tăng khối lượng so với giấy lọc là chất rắn lơ lửng (TSS).
Quy trình phân tích
- Chuẩn bị giấy lọc và đĩa nhôm: tiến hành sấy ở 103-105 oC/1h và làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân giấy lọc + đĩa nhôm được trọng lượng đầu m0.
- Lọc mẫu qua giấy lọc bằng bơm chân không. Sau khi lọc hết mẫu, lấy giấy lọc có chất rắn cho vào đĩa nhôm.
- Sấy đĩa nhôm + giấy lọc ở 103-105oC/1h và làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân đĩa nhôm + giấy lọc + chất rắn.
- Lặp lại “sấy-làm nguội-cân’ cho đến khi thay đổi khối lượng không quá 4% so với lượng cân lần trước. Cuối cùng ta có kết quả m1.
Tính toán: Tổng lượng chất rắn theo công thức: TSS (mg/L) = m1 – m 0
V
2.2.4.3. Xác định nhu cầu oxy sinh hóa BOD5 (Ultimate BOD Test) [40]
Ủ mẫu ở nhiệt độ 20 ± 1 oC trong thời gian 5 ngày, ở chỗ tối, trong bình hoàn toàn đầy và nút kín. Xác định DO trước và sau khi ủ. Từ đó tính ra lượng oxygen tiêu tốn (theo mg) cho 1 L mẫu, tức BOD5. Tùy vào đặc điểm mẫu nước mà ta có thể pha loãng và cấy thêm VSV cho mẫu hoặc không.
Quy trình phân tích
- Mẫu nước từ ao nuôi tôm được xác định BOD5 trực tiếp không cần pha loãng và không cấy thêm VSV.
- Cho mẫu nước vào đầy 2 chai Winker rồi dùng nút đậy nhanh và tránh tạo thành bọt khí trong chai. Đặt 1 chai Winker trên máy khuấy từ, thả cục từ vào, khuấy nhẹ trong suốt thời gian đo với điện cực của máy đo DO. Đọc kết quả DO đầu (DO1). Chai còn lại được ủ ở nhiệt độ 20 ± 0,5 oC trong buồng tối. Sau 5 ngày tiến hành đo như trên để lấy giá trị DO cuối (DO2).
Tính toán: BOD5 (mg/L)= DO2 – DO1
2.2.4.4. Xác định nhu cầu oxy hóa học COD: Phương pháp oxy hóa bởi K2Cr2O7 [40].
Nguyên tắc:
Khi phân hủy mẫu, ion dichromate (Cr2O72-) oxy hóa chất hữu cơ và bị khử về chromic (Cr3+), cả 2 dạng Cr này đều hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến. Ở vùng 400 nm, ion dichromate (màu vàng) hấp thụ mạnh, ion chromium (màu xanh) hấp thụ rất yếu. Ion chromium hấp thụ mạnh ở vùng 600 nm trong khi ion dichromate không hấp thụ.
Với mẫu COD cao (100-900 mg/L) đo độ hấp thụ quang dung dịch sau phân hủy ở 600 nm (đo Cr3+ gia tăng). Với mẫu có COD thấp đo độ hấp thụ quang dung dịch sau phân hủy ở 420 nm (đo Cr2O72- giảm).
Quy trình phân tích
(*) Khi đo ở 420 nm dùng nước cất để thiết lập giá trị zero
Tính toán
Xây dựng đường chuẩn từ các dung dịch làm việc ở trên. Đường chuẩn biểu thị sự phụ thuộc hiệu số độ hấp thụ quang của mẫu trắng với mẫu chuẩn theo nồng độ COD. Tính COD của mẫu theo đường chuẩn từ hiệu số độ hấp thụ quang của mẫu trắng và mẫu cần xác định.
2.2.4.5. Xác định Phosphate (P-PO43-) sử dụng phương pháp Ascorbic [40]
Nguyên tắc
Ammonium molybdate và potassium antimonyl tartrate phản ứng với orthophosphate (dạng phosphorus hòa tan) trong môi trường acid mạnh tạo thành acid phosphomolybdic, acid này bị khử bởi acid ascorbic cho hợp chất có màu xanh molybdenum hấp thụ mạnh ở bước sóng 880 nm.
2,5 mL dung dịch chuẩn/mẫu (trong ống nghiệm 20 mL) Thêm 1,5 mL dung dịch phân hủy.
Thêm cẩn thận 3,5 mL H2SO4/Ag+ (cho chảy dọc thành ống nghiệm). Vặn chặt nắp, đảo vài lần để trộn.