Để thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase của virus dịch tả vịt, chỳng tụi đó sử dụng cặp mồi DTVF và DTVR với chu trỡnh nhiệt đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cỏch điện di trờn trờn thạch agarose 1%. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.2.
Hỡnh 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCRtrờn thạch agarrose 1%
Giếng 1: sản phẩm PCR nhõn gen DNA-polymerase của chủng DTVCĐKN; giếng 2: sản phẩm PCR nhõn gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN cú kớch thƣớc khoảng 0,5 kb; giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể đƣợc cắt bằng enzyme
HindIII) 2.0kb 0,54kb 0,5kb M 1 2 2.0kb 0,54kb 0,5kb M 1 2
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hỡnh 3.2 cho thấy, ở cả hai giếng mẫu DTVCDKN và DTVVXKN đều xuất hiện rừ 1 băng sỏng cú kớch thƣớc khoảng 0,5 kb, tƣơng ứng với đoạn DNA của gen DNA-polymerase với cặp mồi DTVF-DTVR. Kết quả này chứng tỏ toàn bộ quỏ trỡnh thiết kế mồi, tỏch chiết DNA tổng số, thành phần và chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR là chớnh xỏc, cho sản phẩm phản ứng hoàn toàn đặc hiệu với kớch thƣớc dự kiến của cặp mồi thiết kế.
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch bằng bộ húa chất của hóng Bioneer (AccuPrepđ PCR Purification Kit) đƣợc giải trỡnh tự trực tiếp trờn mỏy giải trỡnh tự tự động ABI PRISMđ 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), sử dụng cỏc mồi bỏm trờn gen là DTVF. Trỡnh tự nucleotide và amino acid suy diễn tƣơng ứng của gen DNA-polymerase chủng DTVCDKN và DTVVXKN mà chỳng tụi thu nhận đƣợc, đƣợc trỡnh bày ở Hỡnh 3.3; Hỡnh 3.4.
DTVCDKN-VN gene DNA-polymerase (446bp)
Hỡnh 3.3. Trỡnh tự gen DNA-polymerase của chủng DTVCDKN
(dũng trờn là thành phần nucleotide, dũng dƣới là thành phần amino acid tƣơng ứng biểu thị bằng chữ cỏi (1 chữ cỏi) ký hiệu của chỳng).
Ghi chú: Gen DNA-polymease nằm trên sợi âm (chuỗi bổ sung) của DNA. Trên hình là phần cuối của gen này gồm 222 nucleotit mã hoá cho 154 axit amin (ký hiệu 1 chữ cái). Vị trí và thành phần của cặp mồi (DTVR và DTVF) đ-ợc bôi đậm và gạch bên d-ới.
DTVR> 30 60 90 CAAGGCTCTATTCGGTAATGATCACAAAACTTCGGAAGCTGTTTTAAAACGCTTTATTCCAGAAACATACTGTGAGAGTGACGAAACCGC K A L F G N D H K T S E A V L K R F I P E T Y C E S D E T A> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 120 150 180 AGCACTGCTATCTTCGGCCGGGTTTGCAGAAGTGCGCTTGTACCCAGGGATGCCACTCAGCGAGGAGGAGGAAAATCGTCAAAAGCTGCG A L L S S A G F A E V R L Y P G M P L S E E E E N R Q K L R> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 210 240 270 TAGAGCTTTCGATATTCTAGCAGAAGTTCCCCATCGAAATTAAGGTCGCACATTTTACAATAAATATCTTCAATACTTATCTGTGGTACG R A F D I L A E V P H R N * ________________ADN-polymerase___________> 300 330 360 CTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCGCGCCTCACGACAAGTACGAATGTAGAATGCCAAACATGAGCCATTAGACGGTATCCCCGG 390 420 446 CAAGCAGATTTAAGGCAGTCGATGAGACGATAGTGTAGATGTACGGCATTTCCAGTAAATGGAATGTACATTACATACCCGCCTTC <DTVF
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
DTVVXKN-VN gene DNA polymerase (446bp)
Hỡnh 3.4. Trỡnh tự gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN
(dũng trờn là thành phần nucleotide, dũng dƣới là thành phần amino acid tƣơng ứng biểu thị bằng chữ cỏi (1 chữ cỏi) ký hiệu của chỳng)
Ghi chú: Gen DNA-polymease nằm trên sợi âm (chuỗi bổ sung) của DNA. Trên hình là phần cuối của gen này gồm 222 nucleotit mã hoá cho 154 axit amin (ký hiệu 1 chữ cái). Vị trí và thành phần của cặp mồi (DTVR và DTVF) đ-ợc bôi đậm và gạch bên d-ới.
Cả hai chuỗi nucleotit đ-ợc xử lý bằng phần mềm chuyên biệt và chúng tôi đều thu đ-ợc đoạn DNA có độ dài 446 cặp nucleotit, trong đó đoạn gen DNA-polymerase có độ dài 222 cặp nucleotit, mã hoá cho 154 axit amin và định vị trên chuỗi bổ sung (complement strand). (Truy cập Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy chủng virus dịch tả vịt của Việt Nam gần nh- hoàn toàn đồng nhất với chủng virus vaccine của Mỹ (số đăng ký: AF064639).
DNA-polymerase cú tớnh bảo thủ cao về mặt cấu trỳc, nờn đƣợc cỏc nhà khoa học lựa chọn để xỏc định phả hệ nguồn gốc. Kết quả truy cập Ngõn hàng gen sử dụng cỏc chuỗi nucleotide mới thu nhận cho thấy 2 chủng cung cấp gen DNA-polymerase đều thuộc virus dịch tả vịt.