Virus dịch tả vịt đƣợc Dardiri và Hwang tập trung nghiờn cứu vào năm 1968, (Dardiri, Gailunas, 1968; Hwang, 1968). Tiếp theo khoảng thời gian đú, nhiều nghiờn cứu về virus dịch tả vịt đƣợc cụng bố nhƣng chỉ tập trung vào việc phỏt hiện bệnh, tỡnh hỡnh nhiễm bệnh và triệu chứng lõm sàng, bệnh tớch và một số phƣơng phỏp đối phú với bệnh này (Friend và Franson, 1999; Hansen và cs., 2000; Sandhu và Shawky, 2003). Những năm tiếp theo, mặc dự bệnh dịch tả vịt vẫn xuất hiện và gõy bệnh ở nhiều quốc gia song những cụng bố về virus dịch tả vịt khụng nhiều (Friend và Franson, 1999; Osterrieder, 1999).
Hiện nay, với sự phỏt triển của sinh học phõn tử, cỏc nghiờn cứu sõu hơn về gen/hệ gen của virus dịch tả vịt đó đƣợc tiến hành (Cheng, 2006 ; Liu và cs., 2008; Li và cs., 2009; Xiang và cs., 2011; Wang và cs., 2011; Liu và
cs., 2010; Wu và cs., 2012). Cỏc nghiờn cứu trƣớc hết tập trung về đặc điểm
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
dịch tả vịt: UL1-UL7 (Li và cs., 2009), UL5 (Pan và cs., 2008; Zhu và cs., 2011), UL6 (Nellissery và cs., 2007), UL13 (Asai và cs., 2007) UL16 (He và cs., 2011), UL24 (Jia và cs., 2009), US6, US7 and US8 (Zhao Y, Wang J, 2010), UL 26 (Liu và cs., 2010), gen UL31 (Schnee và cs., 2006;, UL34 (Neubauer và cs., 2002), UL38 (Xiang và cs., 2011), UL44 (Jarosinski và cs.,2010), UL49 (Jarosinski và cs.,2010); UL51 (Shen và cs., 2009), gen UL53 (Zhang và cs., 2010; 2011), gen UL55 (Wu và cs., 2012) và một số phõn đoạn khỏc.
Cho đến nay, đó cú 4 hệ gen của virus dịch tả vịt đƣợc giải mó toàn bộ hệ gen, bao gồm 3 chủng vaccine và một chủng cƣờng độc (Wu và cs., 2012). Cỏc nghiờn cứu về đặc tớnh sinh học phõn tử đó chứng minh virus dịch tả vịt
là thành viờn của họ Herpesviridae, mang những đặc điểm đặc trƣng của họ
này. Tuy nhiờn do đặc tớnh sinh học và phõn loại học của loại virus này cũn chƣa hoàn toàn sỏng tỏ, nờn Ủy ban phõn loại virus học quốc tế (ICTV) đó tạm thời xếp vào nhúm virus chƣa đƣợc xỏc định cụ thể, thuộc họ Herpesviridae (Liu và cs., 2008;; Nicole, Keith, 2009; Olsson và cs., 2009; Wang và cs., 2011).
Tại Việt Nam, những nghiờn cứu về virus dịch tả vịt cũn chƣa nhiều và chỉ mới tập trung ở việc cụng bố tỡnh hỡnh dịch bệnh và cỏc biểu hiện bệnh tớch, triệu chứng lõm sàng (Nguyễn Ngọc Điểm, 2005). Một số cụng bố về kiểm tra đỏp ứng miễn dịch của vaccine và giới thiệu một số vaccine cú nguồn gốc từ nƣớc ngoài (Lờ Văn Lónh, 1991; Nguyễn Đức Hiền, 1999). Đặc biệt chƣa cú cụng bố nào về sinh học phõn tử virus dịch tả vịt ở mức độ gen và so sỏnh phõn tớch hệ gen tại Việt Nam. Chớnh vỡ vậy mà việc bắt đầu và đẩy mạnh nghiờn cứu về virus dịch tả vịt ở Việt Nam là một điều rất cần thiết hiện nay.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyờn liệu
- Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt do Trung tõm Kiểm nghiệm thuốc thỳ y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kớ hiệu là DTVCDKN.
- Chủng virus nhƣợc độc vaccine do Trung tõm Kiểm nghiệm thuốc thỳ y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kớ hiệu là DTVVXKN.
- 20 vịt trƣởng thành (0,7-1kg). Khụng cú khỏng thể virus dịch tả vịt,
2.1.2. Dụng cụ thiết bị
- Cỏc loại mỏy múc bao gồm: Tủ lạnh thƣờng, tủ lạnh õm sõu -80oC
(Sanyo, Nhật Bản), tủ ấm 37oC (Nhật Bản), mỏy ly tõm thƣờng, mỏy ly tõm
lạnh, mỏy PCR (PTC-100 thermal cycler) của MJ. Research Inc. (Mỹ), mỏy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hóng Fermentas và Bio-Rad, mỏy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ), kốm theo mỏy vi tớnh, mỏy ổn nhiệt, mỏy Vortex, Laminair cấy vụ trựng, mỏy giải trỡnh tự tự động ABI Avant Genetic Analyzer 3100, mỏy giải trỡnh tự tự động Applied Bionsystems (ABI) Model 3730XL, bộ pipetman (10l, 20l, 100l, 200l, 1000l và 5000l), mỏy tớnh và cỏc phần mềm sinh - tin học.
- Cỏc dụng cụ thƣờng qui trong phũng thớ nghiệm.
2.1.3. Húa chất
- Bộ kit tỏch chiết DNA tổng số, “AccuPrepđ Genomic DNA Extraction Kit” (hóng BIONEER, Hàn Quốc).
- Bộ kit dựng cho phản ứng PCR do hóng Fermentas cung cấp.
- Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ PCR Purification Kit của hóng BIONEER.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bộ kit dựng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trỡnh tự. - Cỏc dung dịch dựng để điện di trờn thạch agarose.
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
Nội dung nghiờn cứu:
Để đạt đƣợc mục tiờu của đề chỳng tụi tài tiến hành giải quyết những nội dung chớnh sau:
1. Tiếp truyền và bảo quản giống virus dịch tả vit cƣờng độc và nhƣợc độc vaccine.
2. Tỏch chiết DNA tổng số của mẫu virus cƣờng độc và mẫu virus nhƣợc độc dịch tả vịt nghiờn cứu.
3. Thực hiện phản ứng PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu để thu cỏc gen: DNA-polymerase; gen UL5 và gen UL32.
4. Giải mó gen DNA-polymerase, UL5, UL32 của chủng cƣờng độc và chủng vaccine nghiờn cứu.
5. So sỏnh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tƣơng đồng về amino aicd giữa chủng cƣờng độc và nhƣợc độc vaccine của Việt Nam với cỏc chủng của thế giới dựa vào dữ liệu cỏc gen nghiờn cứu.
2.2.1. Phương phỏp tiếp truyền
Chủng virus DTV cƣờng độc đụng khụ đƣợc pha thành huyễn dịch với nƣớc sinh lý ở nồng độ 10-3 (theo tiờu chuẩn ngành của trung tõm kiểm nghiệm thuốc thỳ y tw1), Đõy chớnh là dịch chứa virus để sử dụng cho tiếp truyền. Dựng hỗn dịch chứa virus đó thu đƣợc ở trờn tiờm vào bắp cho 10 vịt mẫn cảm ở lụ thớ nghiệm 1ml/vịt. Theo dừi triệu chứng lõm sàng sau 24h tiờm và mổ khỏm vịt chết 72 đến 96h sau tiờm để kiểm tra bệnh tớch.
Chủng virus nhƣợc độc vaccine tiờm với tỷ lệ 10 liều cho 5 vịt trƣởng thành để kiểm tra tớnh an toàn của vaccine. Theo dừi 14 ngày sau tiờm.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiờm nƣớc sinh lý cho 5 vịt đối chứng liều 1ml/vịt. theo dừi 14 ngày sau tiờm.
2.2.2. Phương phỏp tỏch chiết DNA tổng số
DNA hệ gen của virus đƣợc tỏch chiết bằng bộ sinh phẩm “AccuPrepđ Genomic DNA Extraction Kit” (hóng BIONEER, Hàn Quốc)
* Nguyờn lý tỏch chiết DNA tổng số:
Mẫu DTV khi xử lý đƣợc nghiền trong bộ cối chày nhựa. Để tỏch chiết đƣợc hệ gen của nhõn và hệ gen của ty thể cần phải phỏ vỡ mụ. Huyễn dịch thu đƣợc gồm thành phần chớnh là protein hoặc cú thể cú RNA nờn cần phải loại bỏ chỳng. Loại bỏ protein bằng cỏch bổ sung enzym proteinase K cú tỏc dụng phõn huỷ protein, bổ sung RNase H cú tỏc dụng phỏ huỷ RNA. Sau đú phỏ vỡ màng tế bào ngoài DNA cũn cú cỏc thành phần khỏc của nguyờn sinh chất nờn cần phải tỏch riờng DNA bằng isopropanol rồi thu DNA khi cho lọc trờn màng lọc tớch điện dƣơng.
* Cỏch tiến hành:
Bƣớc 1: Mẫu vật sau khi xử lý đƣợc nghiền trong bộ cối chày nhựa Bƣớc 2: Thờm 200àl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền cho đến khi thành dung dịch đồng nhất. Bổ sung 20àl Proteinase K
(50mg/ml), ủ 60oC trong 3 giờ cho đến khi mụ đƣợc phõn hủy hoàn toàn.
Bƣớc 3: Bổ sung 4àl RNase-A (100mg/ml) và 200àl dung dịch
Binding buffer (AL hoặc GC), lắc mạnh rồi ủ ở 70o
C trong 30 phỳt
Bƣớc 4: Thờm 200àl dung dịch Izopropanol (96 - 100%), rung lắc
trong 15 giõy. Sau đú ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 1 phỳt.
Bƣớc 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột cú màng lọc, ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại bỏ phần dung dịch cặn.
Bƣớc 6: Thờm 500àl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA bỏm vào, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch ly tõm bờn dƣới.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bƣớc 7: Thờm 500àl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa DNA bỏm vào, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch ly tõm bờn dƣới. Ly tõm lại 13000 vũng/phỳt trong 1 phỳt (để làm khụ màng).
Bƣớc 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5 ml mới, thờm 60àl dung dịch Elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phũng trong 2 - 5 phỳt. Sau đú ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phỳt. Bỏ cột, giữ dịch bờn dƣới.
Ghi kớ hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
DNA tổng số tỏch chiết ra đƣợc kiểm tra bằng điện di trờn thạch agarose 0,8%. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phỳt. Chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng tia tử ngoại của mỏy soi chụp gel Dolphin - Doc (WEALTEC, USA).
2.2.3. Kỹ thuật PCR
Phƣơng phỏp đƣợc sử dụng để thu nhận cỏc đoạn gen virus dịch tả vịt là sử dụng phản ứng PCR (Fementas), với chu trỡnh nhiệt phự hợp liệt kờ ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR và chu trỡnh nhiệt trong nghiờn cứu sinh học phõn tử virus dịch tả vịt
Thành phần phản ứng Chu trỡnh nhiệt
2X buffer PCR master mix: 25 àl Primer 1 (10 pM/ àl) 1 àl Primer 2 10 pM/ àl): 1 àl DMSO: 2,5 Khuụn: 2 àl H2O: 18,5àl Tổng số: 50 àl
Thiết kế mồi dựa trờn nguyờn tắc cặp mồi nhõn vựng gen cho sản phẩm cú độ dài chờnh lệch nhau giữa cỏc đối tƣợng chẩn đoỏn, để đỏnh giỏ sử dụng phƣơng phỏp điện di, cú trỡnh tự nhƣ sau:
94oC – 5’ 94oC – 1’ 48oC – 1’ 35 chu kỳ 72oC – 3’ 72oC – 10’ 4oC – 20h 94oC – 5’ 94oC – 1’ 48oC – 1’ 35 chu kỳ 72oC – 3’ 72oC – 10’ 4oC – 20h
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Cỏc cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng trong nghiờn cứu
Tờn mồi Trỡnh tự chuỗi mồi (5’) Hƣớng mồi Gen thƣớc Kớch
DTVF 5’-CAAGGCTCTATTCGGTAATG-3’ Mồi xuụi DNA-pol 446bp
DTVR 5’-GAAGGCGGGTATGTAATGTA-3’ Mồi ngƣợc
HELIF 5’-TGTCCATCAACACCACCTAC-3’ Mồi xuụi
UL5
2568bp
HELIR 5’-ATCATCGCACAATGCTCC-3’ Mồi ngƣợc
DTVUL5F 5’-CCTTGGTTCATCATATTCATCTGCG-3’ Mồi xuụi
DTVUL5R 5'-TGGGCAAGGTACCAGTTCTT-3' Mồi ngƣợc
DTVUL32F 5’-GGTCTTCATTGGGTATGGCATC-3’ Mồi xuụi UL32 1962bp
DTVUL32R 5’-TCGTAGTCAGACATAGGTGCCG-3’ Mồi ngƣợc
Cỏc trỡnh tự tƣơng ứng với đoạn DNA nghiờn cứu từ một số chủng thuộc virus dịch tả vịt đó đƣợc đăng ký tại Ngõn hàng gen và cụng bố trờn cỏc tạp chớ quốc tế, đƣợc sử dụng để so sỏnh đối chiếu.
2.2.4. Phương phỏp tinh sạch sản phẩm PCR
DNA sản phẩm PCR cần đƣợc tinh sạch để loại bỏ cỏc thành phần khỏc,
chỉ giữ lại DNA
Tinh sạch sản phẩm giải trỡnh tự
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ PCR Purification Kit của hóng BIONEER.
+ Cỏch tiến hành:
Bƣớc 1: Thờm dung dịch PB vào sản phẩm PCR cũn lại theo tỷ lệ 5:1, trộn đều bằng pipet cho dung dịch PB tiếp xỳc hoàn toàn với sản phẩm PCR trong hỗn dịch.
Bƣớc 2: Sau đú chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Rồi bỏ dịch ở dƣới, giữ cột.
Bƣớc 3: Thờm 500μl WB lờn màng của cột lọc. Sau đú ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt rồi bỏ phần nƣớc ở dƣới, giữ cột. Ly tõm lại 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt thờm một lần nữa, để làm khụ màng.
Bƣớc 4: Chuyển cột sang một ống Eppedorf 1,5ml mới, thờm 30μl EL, để ở nhiệt độ phũng trong 2 phỳt. Sau đú ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1,5 phỳt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lỳc này, DNA của sản phẩm PCR đƣợc tỏch ra khỏi màng lọc cựng với
dung dịch EL. Lấy dung dịch ở dƣới, bảo quản mẫu ở -20o
C
Sản phẩm sau khi tinh sạch, đƣợc đụng khụ và đọc trỡnh tự trờn mỏy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) càng tinh khiết càng tốt.
2.2.5. Phương phỏp giải trỡnh tự
Phƣơng phỏp giải trỡnh tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quỏ trỡnh tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xỳc tỏc gắn cỏc nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trớ 3’ cú chứa nhúm -OH tự do, khi gặp nucleotide khụng chứa nhúm 3’-OH (ddNTP) thỡ phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trƣng của phƣơng phỏp này là dựng
ddNTP (bị mất 2 nguyờn tử oxy ở vị trớ cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một
cỏch ngẫu nhiờn. Kết quả là tạo ra cỏc đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khỏc nhau và chỉ sai khỏc nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bƣớc của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao
gồm: bung liờn kết, mồi bỏm và enzyme Taq-polymerase cựng cỏc điều kiện
thớch hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20-24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tƣơng ứng (lƣợng nhỏ ddNTP so với dNTP nờn thỉnh thoảng mới cú 1 ddNTP đƣợc sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiờn). Chuỗi DNA sản phẩm đƣợc xỏc định trỡnh tự theo chiều 5’→ 3’ dựng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đỏnh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quột tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trỡnh tự, phõn tớch tự động bằng mỏy với cỏc chƣơng trỡnh phần mềm tin-sinh học.
Chuỗi DNA cuối cựng thu nhận đƣợc bao giờ cũng đƣợc xỏc định theo chiều 5’→3’. Mỗi một lần giải trỡnh tự, chuỗi thụ (chuỗi cú thành phần DNA ban đầu chƣa đƣợc xử lý) cú độ dài khoảng vài trăm đến vài nghỡn nucleotide; thụng thƣờng là 500-2000 nucleotide nếu đƣợc giải trỡnh trờn mỏy giải trỡnh trỡnh tự tự động.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quỏ trỡnh giải trỡnh tự trực tiếp đoạn DNA sản phẩm thu nhận sau tinh sạch đƣợc tiến hành hoặc với một loại mồi, hoặc mồi xuụi (hoặc với mồi ngược) là cỏc chuỗi oligonucleotide đƣợc thiết kế bỏm vào cỏc trỡnh tự đầu tiờn của sản phẩm, mà cỏc mồi này cũng chớnh là cỏc mồi tham gia thực hiện phản ứng PCR/RT-PCR.
2.2.6. Phương phỏp xử lý số liệu sử dụng cỏc phần mềm tin-sinh học
2.2.6.1. Nguyờn tắc chung
Trong quỏ trỡnh sao chộp, cỏc chuỗi DNA luụn luụn cú thành phần nucleotide giống với chuỗi khuụn bố mẹ ban đầu. Nếu cú sai khỏc, thỡ sai khỏc đú cú thể là do lỗi ngẫu nhiờn của sao chộp tổng hợp hoặc do ỏp lực di truyền của tự nhiờn mà hỡnh thành (Grauer, Li, 2000). Những nucleotide sinh ra thế hệ sau khỏc với thế hệ ban đầu thƣờng đƣợc gọi là cỏc đột biến, đú chớnh là nguồn gốc của sự đa dạng và sự đổi mới trong tiến húa (Lờ Quang Huấn, 2007). Đột biến cú thể xảy ra trong một gen, một vựng DNA hay toàn bộ hệ gen, cú thể ở vựng DNA mó húa cho protein hoặc ở vựng khụng mó
húa. Cỏc đột biến tỏc động lờn một nucleotide gọi là cỏc đột biến điểm, hay
tỏc động lờn một số nucleotide cạnh nhau gọi là cỏc đột biến đoạn.
Phõn tớch chuỗi gen (sequence analysis) là xỏc định cỏc cấu trỳc của chuỗi gen và so sỏnh thành phần của chuỗi gen (bao gồm trỡnh tự nucleotide, amino acid), cấu trỳc gen/hệ gen, khung đọc mở (ORF) và nhiều đặc tớnh phõn tử khỏc. So sỏnh đối chiếu chuỗi gen (comparative analysis of sequences) là thao tỏc thực hiện với hai hay nhiều chuỗi gen khỏc. Trong nghiờn cứu thuộc lĩnh vực sinh học phõn tử, phõn tớch chuỗi gen đƣợc thực hiện nhờ sự trợ giỳp của cỏc chƣơng trỡnh tin-sinh học.
Nhiều phƣơng phỏp xõy dựng cõy phả hệ (hay cũn gọi là cõy phỏt sinh loài), đƣợc sử dụng trong nghiờn cứu phõn tử mà chủ yếu dựa trờn số liệu về trỡnh tự DNA, nhƣng cũng cú thể ỏp dụng với cỏc số liệu về trỡnh tự amino acid (Lờ Quang Huấn, 2007; Lờ Thanh Hũa, 2006a).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.6.2. Chương trỡnh so sỏnh và phõn tớch chuỗi gen GeneDoc
GeneDoc là một chƣơng trỡnh nổi (interface application) đƣợc lập trỡnh cho mỏy tớnh PC sử dụng hệ Window, dựng để mở file, đọc và phõn tớch file ở
dạng .msf (multiple sequence file) (Nicholas và cs., 2009). GeneDoc cho phộp
xỏc định trỡnh tự amino acid của gen nhõn và gen ty thể, đƣa ra cấu hỡnh của cỏc chuỗi đó đƣợc so sỏnh để chuyển nạp vào MEGA cho phõn tớch phả hệ.
2.2.6.3. Xử lý số liệu trong nghiờn cứu
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi xử lý giản đồ chromatogram của