Phƣơng phỏp đƣợc sử dụng để thu nhận cỏc đoạn gen virus dịch tả vịt là sử dụng phản ứng PCR (Fementas), với chu trỡnh nhiệt phự hợp liệt kờ ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR và chu trỡnh nhiệt trong nghiờn cứu sinh học phõn tử virus dịch tả vịt
Thành phần phản ứng Chu trỡnh nhiệt
2X buffer PCR master mix: 25 àl Primer 1 (10 pM/ àl) 1 àl Primer 2 10 pM/ àl): 1 àl DMSO: 2,5 Khuụn: 2 àl H2O: 18,5àl Tổng số: 50 àl
Thiết kế mồi dựa trờn nguyờn tắc cặp mồi nhõn vựng gen cho sản phẩm cú độ dài chờnh lệch nhau giữa cỏc đối tƣợng chẩn đoỏn, để đỏnh giỏ sử dụng phƣơng phỏp điện di, cú trỡnh tự nhƣ sau:
94oC – 5’ 94oC – 1’ 48oC – 1’ 35 chu kỳ 72oC – 3’ 72oC – 10’ 4oC – 20h 94oC – 5’ 94oC – 1’ 48oC – 1’ 35 chu kỳ 72oC – 3’ 72oC – 10’ 4oC – 20h
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Cỏc cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng trong nghiờn cứu
Tờn mồi Trỡnh tự chuỗi mồi (5’) Hƣớng mồi Gen thƣớc Kớch
DTVF 5’-CAAGGCTCTATTCGGTAATG-3’ Mồi xuụi DNA-pol 446bp
DTVR 5’-GAAGGCGGGTATGTAATGTA-3’ Mồi ngƣợc
HELIF 5’-TGTCCATCAACACCACCTAC-3’ Mồi xuụi
UL5
2568bp
HELIR 5’-ATCATCGCACAATGCTCC-3’ Mồi ngƣợc
DTVUL5F 5’-CCTTGGTTCATCATATTCATCTGCG-3’ Mồi xuụi
DTVUL5R 5'-TGGGCAAGGTACCAGTTCTT-3' Mồi ngƣợc
DTVUL32F 5’-GGTCTTCATTGGGTATGGCATC-3’ Mồi xuụi UL32 1962bp
DTVUL32R 5’-TCGTAGTCAGACATAGGTGCCG-3’ Mồi ngƣợc
Cỏc trỡnh tự tƣơng ứng với đoạn DNA nghiờn cứu từ một số chủng thuộc virus dịch tả vịt đó đƣợc đăng ký tại Ngõn hàng gen và cụng bố trờn cỏc tạp chớ quốc tế, đƣợc sử dụng để so sỏnh đối chiếu.
2.2.4. Phương phỏp tinh sạch sản phẩm PCR
DNA sản phẩm PCR cần đƣợc tinh sạch để loại bỏ cỏc thành phần khỏc,
chỉ giữ lại DNA
Tinh sạch sản phẩm giải trỡnh tự
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ PCR Purification Kit của hóng BIONEER.
+ Cỏch tiến hành:
Bƣớc 1: Thờm dung dịch PB vào sản phẩm PCR cũn lại theo tỷ lệ 5:1, trộn đều bằng pipet cho dung dịch PB tiếp xỳc hoàn toàn với sản phẩm PCR trong hỗn dịch.
Bƣớc 2: Sau đú chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Rồi bỏ dịch ở dƣới, giữ cột.
Bƣớc 3: Thờm 500μl WB lờn màng của cột lọc. Sau đú ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt rồi bỏ phần nƣớc ở dƣới, giữ cột. Ly tõm lại 13,000 vũng/phỳt trong 1 phỳt thờm một lần nữa, để làm khụ màng.
Bƣớc 4: Chuyển cột sang một ống Eppedorf 1,5ml mới, thờm 30μl EL, để ở nhiệt độ phũng trong 2 phỳt. Sau đú ly tõm 13,000 vũng/phỳt trong 1,5 phỳt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lỳc này, DNA của sản phẩm PCR đƣợc tỏch ra khỏi màng lọc cựng với
dung dịch EL. Lấy dung dịch ở dƣới, bảo quản mẫu ở -20o
C
Sản phẩm sau khi tinh sạch, đƣợc đụng khụ và đọc trỡnh tự trờn mỏy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) càng tinh khiết càng tốt.
2.2.5. Phương phỏp giải trỡnh tự
Phƣơng phỏp giải trỡnh tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quỏ trỡnh tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xỳc tỏc gắn cỏc nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trớ 3’ cú chứa nhúm -OH tự do, khi gặp nucleotide khụng chứa nhúm 3’-OH (ddNTP) thỡ phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trƣng của phƣơng phỏp này là dựng
ddNTP (bị mất 2 nguyờn tử oxy ở vị trớ cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một
cỏch ngẫu nhiờn. Kết quả là tạo ra cỏc đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khỏc nhau và chỉ sai khỏc nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bƣớc của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao
gồm: bung liờn kết, mồi bỏm và enzyme Taq-polymerase cựng cỏc điều kiện
thớch hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20-24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tƣơng ứng (lƣợng nhỏ ddNTP so với dNTP nờn thỉnh thoảng mới cú 1 ddNTP đƣợc sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiờn). Chuỗi DNA sản phẩm đƣợc xỏc định trỡnh tự theo chiều 5’→ 3’ dựng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đỏnh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quột tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trỡnh tự, phõn tớch tự động bằng mỏy với cỏc chƣơng trỡnh phần mềm tin-sinh học.
Chuỗi DNA cuối cựng thu nhận đƣợc bao giờ cũng đƣợc xỏc định theo chiều 5’→3’. Mỗi một lần giải trỡnh tự, chuỗi thụ (chuỗi cú thành phần DNA ban đầu chƣa đƣợc xử lý) cú độ dài khoảng vài trăm đến vài nghỡn nucleotide; thụng thƣờng là 500-2000 nucleotide nếu đƣợc giải trỡnh trờn mỏy giải trỡnh trỡnh tự tự động.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quỏ trỡnh giải trỡnh tự trực tiếp đoạn DNA sản phẩm thu nhận sau tinh sạch đƣợc tiến hành hoặc với một loại mồi, hoặc mồi xuụi (hoặc với mồi ngược) là cỏc chuỗi oligonucleotide đƣợc thiết kế bỏm vào cỏc trỡnh tự đầu tiờn của sản phẩm, mà cỏc mồi này cũng chớnh là cỏc mồi tham gia thực hiện phản ứng PCR/RT-PCR.
2.2.6. Phương phỏp xử lý số liệu sử dụng cỏc phần mềm tin-sinh học
2.2.6.1. Nguyờn tắc chung
Trong quỏ trỡnh sao chộp, cỏc chuỗi DNA luụn luụn cú thành phần nucleotide giống với chuỗi khuụn bố mẹ ban đầu. Nếu cú sai khỏc, thỡ sai khỏc đú cú thể là do lỗi ngẫu nhiờn của sao chộp tổng hợp hoặc do ỏp lực di truyền của tự nhiờn mà hỡnh thành (Grauer, Li, 2000). Những nucleotide sinh ra thế hệ sau khỏc với thế hệ ban đầu thƣờng đƣợc gọi là cỏc đột biến, đú chớnh là nguồn gốc của sự đa dạng và sự đổi mới trong tiến húa (Lờ Quang Huấn, 2007). Đột biến cú thể xảy ra trong một gen, một vựng DNA hay toàn bộ hệ gen, cú thể ở vựng DNA mó húa cho protein hoặc ở vựng khụng mó
húa. Cỏc đột biến tỏc động lờn một nucleotide gọi là cỏc đột biến điểm, hay
tỏc động lờn một số nucleotide cạnh nhau gọi là cỏc đột biến đoạn.
Phõn tớch chuỗi gen (sequence analysis) là xỏc định cỏc cấu trỳc của chuỗi gen và so sỏnh thành phần của chuỗi gen (bao gồm trỡnh tự nucleotide, amino acid), cấu trỳc gen/hệ gen, khung đọc mở (ORF) và nhiều đặc tớnh phõn tử khỏc. So sỏnh đối chiếu chuỗi gen (comparative analysis of sequences) là thao tỏc thực hiện với hai hay nhiều chuỗi gen khỏc. Trong nghiờn cứu thuộc lĩnh vực sinh học phõn tử, phõn tớch chuỗi gen đƣợc thực hiện nhờ sự trợ giỳp của cỏc chƣơng trỡnh tin-sinh học.
Nhiều phƣơng phỏp xõy dựng cõy phả hệ (hay cũn gọi là cõy phỏt sinh loài), đƣợc sử dụng trong nghiờn cứu phõn tử mà chủ yếu dựa trờn số liệu về trỡnh tự DNA, nhƣng cũng cú thể ỏp dụng với cỏc số liệu về trỡnh tự amino acid (Lờ Quang Huấn, 2007; Lờ Thanh Hũa, 2006a).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.6.2. Chương trỡnh so sỏnh và phõn tớch chuỗi gen GeneDoc
GeneDoc là một chƣơng trỡnh nổi (interface application) đƣợc lập trỡnh cho mỏy tớnh PC sử dụng hệ Window, dựng để mở file, đọc và phõn tớch file ở
dạng .msf (multiple sequence file) (Nicholas và cs., 2009). GeneDoc cho phộp
xỏc định trỡnh tự amino acid của gen nhõn và gen ty thể, đƣa ra cấu hỡnh của cỏc chuỗi đó đƣợc so sỏnh để chuyển nạp vào MEGA cho phõn tớch phả hệ.
2.2.6.3. Xử lý số liệu trong nghiờn cứu
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi nucleotide thụ bằng chƣơng trỡnh SeqEd v1.03, sau đú so sỏnh cỏc chuỗi sử dụng chƣơng trỡnh AsemblyLIGN v1.9 và phõn tớch thành phần nucleotide và amino acid hoặc cỏc đặc tớnh gen và polypeptide bằng hệ chƣơng trỡnh MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trờn mỏy tớnh Macintosh. Trờn mỏy tớnh PC, cỏc chuỗi nucleotide hay amino acid đƣợc sắp xếp và tớnh toỏn
mức độ tƣơng đồng bằng chƣơng trỡnh GeneDoc v2.5 (Nicholas và cs., 1997).
Cỏc chuỗi gen UL5, UL32 và DNA-polymerase và toàn bộ khung đọc mở (ORF) đƣợc sử dụng để phõn tớch, so sỏnh về thành phần nucleotide và amino acid, cũng nhƣ phõn tớch mối quan hệ phả hệ giữa cỏc chủng của Việt Nam và thế giới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tiếp truyền virus
Virus cƣờng độc dịch tả vịt (DTVCDKN) đƣợc chuẩn bị và tiến hành tiếp truyền trờn vịt trƣởng thành. Mục đớch của thớ nghiệm này nhằm kiểm tra tớnh gõy bệnh (độc lực) của virus và nhõn mẫu bệnh phẩm của virus cƣờng độc dịch tả vịt nghiờn cứu. Sau khi gõy bệnh, vịt đƣợc theo dừi chặt chẽ để ghi nhận những diễn biến của bệnh về triệu chứng lõm sàng cũng nhƣ số vịt chết.
Virus nhƣợc độc vaccine dịch tả vịt (DTVVXKN) cũng đƣợc sử dụng để tiếp truyền trờn vịt mẫn cảm với mục đớch kiểm tra tớnh an toàn của giống virus vaccine.
Vịt đối chứng đƣợc tiờm nƣớc muối sinh lý và nuụi cỏch ly với lụ vịt thớ nghiệm và cũng đƣợc chăm súc, nuụi dƣỡng nhƣ đối với vịt thớ nghiệm.
Sau 72- 96h, vịt đƣợc mổ khỏm kiểm tra bệnh tớch và thu gan vịt bệnh.
Mẫu bệnh phẩm (gan) đƣợc bảo quản ở -200
C cho đến khi sử dụng cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo. Kết quả tiếp truyền đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả tiếp truyền virus dịch tả vịt trờn vịt mẫn cảm
Tờn chủng Số vịt (con)
Đƣờng
tiờm Liều lƣợng Nhiễm bệnh
Chết sau tiờm (72- 96h) Vịt an toàn sau tiờm 14 ngày DTVCDKN 10 Tiờm bắp 1ml (NĐ10-3) 10/10 10/10
DTVVXKN 5 Tiờm bắp 10liều 0/5 0/5 Khỏe mạnh
Nƣớc sinh lý 5 Tiờm bắp 1ml 0/5 0/5 Khỏe mạnh
Sau khi đƣợc gõy nhiễm bằng chủng virus cƣờng độc DTVCDKN đều thể hiện triệu chứng và bệnh tớch tƣơng tự nhƣ nhau. Triệu chứng lõm sàng dễ nhận biết sớm nhất là hiện tƣợng vịt bỏ ăn, khỏt nƣớc, xó cỏnh, đầu gục,
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
khụng vận động, xự lụng (Hỡnh 3.1 A). Tiếp theo đú, vịt cú hiện tƣợng tiờu chảy, phõn xanh, nhiều nƣớc, mỏ xanh nhạt, lỗ huyệt nhuốm mỏu và phự đầu. Cả đàn vịt gầy ốm rất nhanh và chết trong vũng 3 - 5 ngày với tỷ lệ chết là 10/10 (100%) (Bảng 3.1).
Kết quả mổ khỏm kiểm tra bệnh tớch cho thấy cú xuất huyết điểm dày đặc khắp cơ thể. Ở trờn và trong cơ tim, ruột, màng treo ruột cú xuất huyết và tụ mỏu. Ở van tim, gan, tụy, thận cú xuất huyết điểm. Ở dạ dày tuyến, thực quản xuất huyết thành vũng. Trờn niờm mạc đƣờng tiờu húa cú hiện tƣợng nổi ban với kớch thƣớc 1-10 mm. (Hỡnh 3.1 B,C,D).
Hỡnh 3.1. Triệu chứng và bệnh tớch vịt bị bệnh dịch tả vịt
A. Vịt đƣợc đỏnh dấu đỏ triệu chứng xó cỏnh; B. Gan, tim bị xuất huyết C. Ruột bị xuất huyết; D. Dạ dày tuyến bị xuất huyết
A B
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ở lụ vịt đƣợc tiờm virus vaccine và lụ đối chứng tiờm nƣớc muối sinh lý, vịt đều khỏe mạnh bỡnh thƣờng 14 ngày tiờm. Kết quả mổ khỏm kiểm tra khụng thấy bất cứ một dầu hiệu bệnh tớch nào.
Kết quả thớ nghiệm cho thấy sau khi gõy nhiễm virus cƣờng độc, tỷ lệ vịt ốm và chết đạt tới 100%. Điều này phự hợp với kết quả nghiờn cứu của nhiều tỏc giả: Trần Minh Chõu (1987), Nguyễn Xuõn Bỡnh (2004).
Ngay sau khi vịt chết, tiến hành mổ thu gan và bảo quản ở -20o
C cho đến khi sử dụng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen nghiờn cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DNA tổng số bao gồm cả DNA hệ gen của virus đƣợc tỏch chiết bằng
bộ sinh phẩm “AccuPrepđ
Genomic DNA Extraction Kit” (hóng BIONEER, Hàn Quốc) từ mẫu virus cƣờng độc và mẫu virus vaccine dịch tả vịt theo đỳng
quy trỡnh hƣớng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, sau đú bảo quản ở -20o
C cho đến khi sử dụng để thực hiện phản ứng PCR.
3.2.1. Kết quả thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase và giải trỡnh tự
Để thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase của virus dịch tả vịt, chỳng tụi đó sử dụng cặp mồi DTVF và DTVR với chu trỡnh nhiệt đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cỏch điện di trờn trờn thạch agarose 1%. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.2.
Hỡnh 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCRtrờn thạch agarrose 1%
Giếng 1: sản phẩm PCR nhõn gen DNA-polymerase của chủng DTVCĐKN; giếng 2: sản phẩm PCR nhõn gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN cú kớch thƣớc khoảng 0,5 kb; giếng M: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể đƣợc cắt bằng enzyme
HindIII) 2.0kb 0,54kb 0,5kb M 1 2 2.0kb 0,54kb 0,5kb M 1 2
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hỡnh 3.2 cho thấy, ở cả hai giếng mẫu DTVCDKN và DTVVXKN đều xuất hiện rừ 1 băng sỏng cú kớch thƣớc khoảng 0,5 kb, tƣơng ứng với đoạn DNA của gen DNA-polymerase với cặp mồi DTVF-DTVR. Kết quả này chứng tỏ toàn bộ quỏ trỡnh thiết kế mồi, tỏch chiết DNA tổng số, thành phần và chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR là chớnh xỏc, cho sản phẩm phản ứng hoàn toàn đặc hiệu với kớch thƣớc dự kiến của cặp mồi thiết kế.
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch bằng bộ húa chất của hóng Bioneer (AccuPrepđ PCR Purification Kit) đƣợc giải trỡnh tự trực tiếp trờn mỏy giải trỡnh tự tự động ABI PRISMđ 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), sử dụng cỏc mồi bỏm trờn gen là DTVF. Trỡnh tự nucleotide và amino acid suy diễn tƣơng ứng của gen DNA-polymerase chủng DTVCDKN và DTVVXKN mà chỳng tụi thu nhận đƣợc, đƣợc trỡnh bày ở Hỡnh 3.3; Hỡnh 3.4.
DTVCDKN-VN gene DNA-polymerase (446bp)
Hỡnh 3.3. Trỡnh tự gen DNA-polymerase của chủng DTVCDKN
(dũng trờn là thành phần nucleotide, dũng dƣới là thành phần amino acid tƣơng ứng biểu thị bằng chữ cỏi (1 chữ cỏi) ký hiệu của chỳng).
Ghi chú: Gen DNA-polymease nằm trên sợi âm (chuỗi bổ sung) của DNA. Trên hình là phần cuối của gen này gồm 222 nucleotit mã hoá cho 154 axit amin (ký hiệu 1 chữ cái). Vị trí và thành phần của cặp mồi (DTVR và DTVF) đ-ợc bôi đậm và gạch bên d-ới.
DTVR> 30 60 90 CAAGGCTCTATTCGGTAATGATCACAAAACTTCGGAAGCTGTTTTAAAACGCTTTATTCCAGAAACATACTGTGAGAGTGACGAAACCGC K A L F G N D H K T S E A V L K R F I P E T Y C E S D E T A> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 120 150 180 AGCACTGCTATCTTCGGCCGGGTTTGCAGAAGTGCGCTTGTACCCAGGGATGCCACTCAGCGAGGAGGAGGAAAATCGTCAAAAGCTGCG A L L S S A G F A E V R L Y P G M P L S E E E E N R Q K L R> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 210 240 270 TAGAGCTTTCGATATTCTAGCAGAAGTTCCCCATCGAAATTAAGGTCGCACATTTTACAATAAATATCTTCAATACTTATCTGTGGTACG R A F D I L A E V P H R N * ________________ADN-polymerase___________> 300 330 360 CTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCGCGCCTCACGACAAGTACGAATGTAGAATGCCAAACATGAGCCATTAGACGGTATCCCCGG 390 420 446 CAAGCAGATTTAAGGCAGTCGATGAGACGATAGTGTAGATGTACGGCATTTCCAGTAAATGGAATGTACATTACATACCCGCCTTC <DTVF
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
DTVVXKN-VN gene DNA polymerase (446bp)
Hỡnh 3.4. Trỡnh tự gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN
(dũng trờn là thành phần nucleotide, dũng dƣới là thành phần amino acid tƣơng ứng biểu thị bằng chữ cỏi (1 chữ cỏi) ký hiệu của chỳng)
Ghi chú: Gen DNA-polymease nằm trên sợi âm (chuỗi bổ sung) của DNA. Trên hình là phần cuối của gen này gồm 222 nucleotit mã hoá cho 154 axit amin (ký hiệu 1 chữ cái). Vị trí và thành phần của cặp mồi (DTVR và DTVF) đ-ợc bôi đậm và gạch bên d-ới.
Cả hai chuỗi nucleotit đ-ợc xử lý bằng phần mềm chuyên biệt và chúng tôi đều thu đ-ợc đoạn DNA có độ dài 446 cặp nucleotit, trong đó đoạn gen DNA-polymerase có độ dài 222 cặp nucleotit, mã hoá cho 154 axit amin và định vị trên chuỗi bổ sung (complement strand). (Truy cập Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy chủng virus dịch tả vịt của Việt Nam gần nh- hoàn toàn đồng nhất với chủng virus vaccine của Mỹ (số đăng ký: AF064639).
DNA-polymerase cú tớnh bảo thủ cao về mặt cấu trỳc, nờn đƣợc cỏc nhà khoa học lựa chọn để xỏc định phả hệ nguồn gốc. Kết quả truy cập Ngõn hàng gen sử dụng cỏc chuỗi nucleotide mới thu nhận cho thấy 2 chủng cung cấp gen DNA-polymerase đều thuộc virus dịch tả vịt.
3.2.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) và giải trỡnh tự
Với thành phần và chu trỡnh nhiệt (bảng 2.1), chỳng tụi đó khuếch đại đƣợc gen Helicase (UL5) của chủng DTVCDKN và DTVVXKN cú kớch thƣớc khoảng 2,5kb, kết quả đƣợc trỡnh bày ở Hỡnh 3.5.
DTVR> 30 60 90 CAAGGCTCTATTCGGTAATGATCACAAAACTTCGGAAGCTGTTTTAAAACGCTTTATTCCAGAAACATACTGTGAGAGTGACGAAACCGC K A L F G N D H K T S E A V L K R F I P E T Y C E S D E T A> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 120 150 180 AGCACTGCTATCTTCGGCCGGGTTTGCAGAAGTGCGCTTGTACCCAGGGATGCCACTCAGCGAGGAGGAGGAAAATCGTCAAAAGCTGCG A L L S S A G F A E V R L Y P G M P L S E E E E N R Q K L R> ____________________________________ADN-polymerase_______________________________________> 210 240 270 TAGAGCTTTCGATATTCTAGCAGAAGTTCCCCATCGAAATTAAGGTCGCACATTTTACAATAAATATCTTCAATACTTATCTGTGGTACG R A F D I L A E V P H R N * ________________ADN-polymerase___________> 300 330 360 CTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCGCGCCTCACGACAAGTACGAATGTAGAATGCCAAACATGAGCCATTAGACGGTATCCCCGG 390 420 446 CAAGCAGATTTAAGGCAGTCGATGAGACGATAGTGTAGATGTACGGCATTTCCAGTAAATGGAATGTACATTACATACCCGCCTTC <DTVF
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCRtrờn thạch agarrose 1%