độ bổ sung.
Kết quả cho thấy hoạt chất PCA bền khi xử lý với các yếu tố lý hóa nhƣ nhiệt độ, pH và proteinase K (Hình 3.17 và Hình 3.18). Hoạt chất PCA đƣợc xử lý với nhiệt độ 100°C ở thời gian khác nhau hình 3.17A, sau một giờ xử lý hoạt tính giữ đƣợc 80-90% so với mẫu đối chứng. Ở pH 2 hoạt tính của hoạt chất PCA tăng nhẹ, pH 4 hoạt tính ức chế nấm của PCA giảm nhẹ, ở pH 10 hoạt chất PCA vẫn giữ trên 90% hoạt tính. Khi xử lý PCA với proteinase K ở nồng độ từ 0,1-1,0 mg/ml hoạt tính ức chế hầu nhƣ không thay đổi, điều này có thể giải thích do cấu tạo của PCA không có cấu trúc protein nên không bị ảnh hƣởng bởi proteinase K xử lý.
So với dịch lọc từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1 hoạt chất PCA kém bền hơn khi xử lý với các yếu tố nhiệt độ, pH, proteinase K. Hoạt tính giảm nhiều hơn khi xử lý với nhiệt độ và pH, proteinase K hầu nhƣ không ảnh hƣởng tới hoạt tính của PCA. Từ đó có thể thấy hoạt chất PCA có khả năng sử dụng ở những điều kiện về nhiệt độ và pH khá rộng, điều này cũng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết, tinh sạch cũng nhƣ bảo quản sử dụng hoạt chất PCA.
3.5.4 Hoạt tính ức chế tối thiểu (MIC) của hoạt chất PCA với nấm R. solani và F. oxysporum oxysporum
Hoạt chất tinh sạch PCA đƣợc thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm R. solani và F. oxysporum bằng phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.
0 20 40 60 80 100 30 40 50 60 70 80 Nồng độ PCA (microgram/ml) Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani
Hình 3.19. Khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh sạch từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả hình 3.19 và hình 3.20 cho thấy hoạt chất PCA tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1 có khả năng ức chế sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani rất tốt. Ở nồng độ 30 μg/ml hoạt chất PCA ức chế 71% với nấm F. oxysporum và 76% với nấm R. solani. Ở nồng độ 50μg/ml hoạt chất PCA đã ức chế đƣợc 95% với nấm F. oxysporum và 97% với nấm R. solani. Khi ở nồng độ 80 g/ml hoạt chất PCA tinh sạch đƣợc có khả năng ức chế hoàn toàn sự sinh trƣởng và phát triển của nấm R. solani và ức chế đƣợc 97% với nấm F. oxysporum.
Qua đó cho thấy khả năng ức chế nấm F. oxysporum của hoạt chất PCA ở nồng độ cao giảm mạnh, ở các nồng độ tăng dần từ 50 μg/ml đến 80 μg/ml khả năng ức chế thêm của PCA chỉ tăng thêm 2% do đó khó xác định đƣợc nồng độ MIC của PCA với nấm F. oxysporum. Makarand và cộng sự (2007) đã công bố cho thấy giá trị MIC của PCA từ chủng P. aeruginosa ID 4365 với nấm S. rolfssi ở nồng độ 29 μg/ml, ở nồng độ 50 μg/ml PCA ức chế F. oxysporum cũng chỉ đạt 92% (Makarand
et al., 2007).
A
B
Hình 3.20. Hoạt tính ức chế tối thiểu của PCA với F. oxysporum (A) và R. solani (B) tách chiết và tinh sạch từ dịch nuôi cấy chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở nồng độ: 30, 40, 50, 60, 70, 80 g/ml
Theo một số công bố trên thế giới giá trị MIC của hoạt chất PCA đã đƣợc xác định trên một số loài nấm thử nghiệm. Keel và cộng sự (1992) cho rằng hoạt chất 2,4-diacetylphloroglucinol tinh sạch từ chủng P. fluorescens có giá trị MIC với nấm F. oxysporum sp. lycopersici và F. oxysporum sp. lini là 128 μg/ml, với nấm R. solani là 128 μg/ml (Keel et al., 1992). Makarand và cộng sự (2007) hoạt chất phenazine-1-carboxylic acid tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ID 4365 có khả năng ức chế nấm A. niger, F. oxysporum, S. Rolfssi và C. falcatum. Giá trị MIC của PCA với nấm S. rolfssi ở nồng độ 29 μg/ml, ở nồng độ 50 μg/ml PCA có khả năng ức chế sinh trƣởng với nấm A. niger đạt 96%, C. falcatum đạt 97%, F. oxysporum đạt 92% (Makarand et al., 2007). Uzair và cộng sự (2008) công bố chủng P. aeruginosa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mentagrophytes, Rhizopus, dịch chiết acetone từ dịch nuôi cấy có giá trị MIC từ 50- 75 μg/ml với các nấm thử nghiệm (Uzair et al., 2008).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Tuyển chọn đƣợc chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 có khả năng đối ức chế mạnh với nấm bệnh cây F. oxysporum và R. solani. Định danh 16S rRNA cho thấy chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 có độ tƣơng đồng 98% với loài P. aerigunosastrain
TAUC7 có mã số HQ914782.1. Trình tự 16S rRNA từ chủng Pseudomonas sp.
ĐA3.1 đƣợc đăng ký trên Genbank với mã số JN592444.1.
2. Dịch lọc ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 có khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R. solani hiệu quả, ức chế sự sinh trƣởng và phát triển của chủng nấm tƣơng ứng đạt 88% và 95% khi thử ở nồng độ 10%. Dịch lọc ngoại bào bền với nhiệt độ, pH và proteinase K.
3. Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch hoạt chất PCA từ dịch ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 với các thông số kỹ thuật: hoạt chất đƣợc chiết với ethyl axetat với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1:1 v/v; thời gian chiết 2 giờ, cặn cô quay đƣợc hòa trong methanol và đƣợc tinh sạch qua cột silicagel với hệ dung môi chloroform:ethyl axetat. Từ các phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC và các đặc trƣng lý hóa đã xác định hoạt chất tinh sạch đƣợc là phenazine-1-carboxylic axit.
4. Hoạt chất PCA tinh sạch khá bền với nhiệt độ, khi ủ ở 100°C ở các khoảng thời gian khác nhau hoạt tính kháng nấm vẫn duy trì đƣợc 80-90%. Hoạt chất PCA hoạt động ở dải pH rộng từ 2-10, proteinase K không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính ức chế nấm của PCA.
5. Giá trị MIC của hoạt chất PCA tinh sạch với nấm R. salani là 80 μg/ml. Ở nồng độ 80 μg/ml hoạt chất PCA ức chế đƣợc 97% sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxysporum.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu phối trộn với các chất phụ gia phù hợp để tạo thành chế phẩm có khả năng diệt nấm cao với các thông số kỹ thuật phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam.
2. Thử nghiệm trong nhà lƣới với các nồng độ chế phẩm khác nhau để đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm và bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm ở diện hẹp trên đồng ruộng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt:
Bùi Thị Ngần (2001) Nghiên cứu một số bệnh hại bông quan trọng (giác ban, đốm – cháy lá, mốc trắng) ở phía Nam và biện pháp phòng trừ. Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam
Cục Y Tế Dự Phòng Và Môi Trƣờng – Bộ Y Tế (2009) Gần 5000 ngƣời nhiễm độc
thuốc bảo vệ thực vật.
http://www.thuocbietduoc.com.vn/home/newdt8490tt2ev4.aspx
Đại học Quốc gia Hà Nội, 2009, Nguy cơ nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật ngày một gia tăng. URL có tại http://ca.cand.com.vn/vi- VN/thoisuxahoi/tintucsukien/2009/12/155481.cand
Đào Kiều Dung (1999) Kết quả bƣớc đầu khảo sát sự phân bố của các dòng nấm
Trichoderma ở Bến Tre và Tiền Giang. Tạp chí NN và CN Thực phẩm 4: 158-159.
Đỗ Tấn Dũng (2007) Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kuhn) hại một số cây trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006. Tạp chí bảo vệ thực vật 1
Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Ngọc Dũng (2011) Pseudomonas aeruginosa strain ĐA3.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank: JN592444.1
Đoàn Thị Thanh (2005) Nghiên cứu đa dạng sinh học của các isolates nấm
Fusarium spp. ở Việt Nam và một số nƣớc khác. Tập san bảo vệ thực vật 1 Lê Thị Hồng Minh, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Kim Cúc (2005) Tách dòng và
giải trình tự đoạn gen PhlD mã hóa cho 2,4-diacetylphloroglucinol từ
Serratia marcescens kháng Fusarium oxysporum. In: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, pp. 1315-1317. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội
Nguyễn Kim Vân (2003) Nghiên cứu các chủng nấm Rhicoctonia solani Kühn gây hại cải bắp và bƣớc đầu khảo sát biện pháp phòng trừ. Tạp chí bảo vệ thực vật 192: 18-21.
Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng (2003) Xác định mối quan hệ di truyền của các chủng Pseudomonas fluorescens Ps7-1 và P. chlororaphis Ps9-1 trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide gene 16S rRNA. In: Tuyển tập Hội thảo Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học lần thứ hai, pp. 818-821
Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh (2007) Khả năng phân hủy sợi nấm và mối quan hệ di truyền của chủng Bacillus sp. TD67. In: Tuyển tập Hội thảo những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb Khoa học và Kỹ thuật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2005) Xác định đặc điểm chủng Bacillus sp. TD67. In: Tuyển tập hội thảo Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, pp. 106-108. Nxb Khoa học và Kỹ thuật
Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh (2003) Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang trong phòng chống nấm gây bệnh cây trồng. In: Tuyển tập Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003. Nxb Khoa học và Kỹ thuật
Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Ngọc Dũng (2004) Sự hiện diện của vi khuẩn
Pseudomonas sinh huỳnh quang trong các mẫu khác nhau và khả năng đối kháng nấm gây bệnh cây trồng Fusarium oxysporum của chúng. Tạp chí Sinh học 26: 67-71.
Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2006) Nghiên cứu cơ chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh ở cây trồng của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc.
Tạp chí Sinh học 28: 77-81.
Trần Phƣơng Thảo, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2007) Sự tác động tƣơng tác giữa chủng Bacillus sp. TD67 và nấm gây bệnh cây Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro. Tạp chí CNSH 5: 447-452.
Trần Thị Thuần (1997) Cơ chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với nấm bệnh hại cây trồng. Tạp chí bảo vệ thực vật 4: 33-35.
Trần Thị Thuần, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Thị Ly (2004) Qui trình sản xuất và hiệu quả phòng trừ một số bệnh của chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma.
Tạp chí NN và PTNT
Tài liệu tiếng Anh:
Abbott WS (1925) A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol 18: 265-267.
Andrews JH (1992) Biological control in the phyllosphere. Annu Rev Phytopathology 30: 603–635.
Aziz LM, Hamza SJ, Abdul-Rahman IA (2012) Isolation and characterization of phenazine produced from mutant Pseudomonas aeruginosa. Al-Anbar J. Vet. Sci. 5
Baltch AL, Smith RP (1995) Pseudomonas aeruginosa : Infections and Treatment.
N Engl J Med 332: 616-617.
Blazevic DJ, Köpcke MH, Matsen JM (1973) Incidence and identification of
Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida in the clinical laboratory.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Breidenstein EB, Fuente-Núñez C, Hancock RE (2011) Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol 19: 419–26.
Budzikiewicz H (1993) Secondary metabolites from fluorescent Pseudomonads.
FEMS Microbiol. Rev. 104: 209-228.
Carrasco C (1989) Pesticide Productivity Revisited. In. MA, University of Massachusetts
Ceresini P (2011) "Rhizoctonia Solani." Rhizoctonia Solani. In. NC State University
Chythanya R, Karunasagar I (2002) Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208: 1-10.
Cook RJ, Rovira AD (1976) The role of bacteria in the biological control of
Gaeumannomyces graminis by suppressive soils. Soil Biol Biochem 8: 269- 273.
De Lucca AJ, Jacks TJ, Takemoto JY, al. e (1999) Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of syringomycin-E. Antimicrob Agents Chemother 43: 371-373. Doring G, Holder IA, Botzenhart K (1987) Basic Research and Clinical Aspects of
Pseudomonas aeruginosa. Antibiot Chemother 39: 1-15.
Dowling DN, O’Gara F (1994) Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease. Trends Biotechnol 12: 133–141.
Farr DF, Bills GF, Chamuris GP, Rossman AY (1989) Fungi on plants and plant products in the United States. In. American Phytopathological Society, St. Paul, Minn
Fenton AM, Stephens PM, Crowley J, O’Callaghan M, O’Gara F (1992) Exploitation of gene(s) involved in 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis to confer a new biocontrol capability to a Pseudomonas strain. Appl Environ Microbiol 58: 3873–3878.
Gerhardson B (2002) Biological substitutes for pesticides. Trends Biotechnol 20: 338-343.
Gordon TR, Martyn RD (1997) The evolutionary biology of Fusarium oxysporum.
Annu. Rev. Phytopathol 35: 111-128.
Grube A, Donaldson D, Kiely T, Wu L (2011) Pesticides industry sales and usage, 2006 and 2007 market estimates.
Gupta CP, Dubey RC, Kang SC, Maheshwari DK (2001) Antibiosis-mediated necrotrophic effect of Pseudomonas GRC2 against two fungal plant pathogens. Curr. Sci. 81: 91-94.
Handelsman J, Stabb EV (1996) Biocontrol of Soilborne Plant Pathogens. Plant Cell 8: 1855-1869.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hart K, Pimentel D (2002) Public health and costs of pesticides. In, pp. 677-679. Encyclopedia of Pest Management, Marcel Dekker, New York
Henkes GJ, Jousset A, Bonkowski M, Thorpe MR, Scheu S, Lanoue A, Schurr U, Rose USR (2011) Pseudomonas fluorescens CHA0 maintains carbon delivery to Fusarium graminearum-infected roots and prevents reduction in biomass of barley shoots through systemic interactions. J Exp Bot. 62: 4337– 4344.
Hill DS, Stein JI, Torkewitz NR, Morse AM, Howell CR, Pachlatko JP, Becker JO, Ligon JM (1994) Cloning of genes involved in the synthesis of pyrrolnitrin from Pseudomonas fluorescens and role of pyrrolnitrin synthesis in biological control of plant disease. Appl. Environ. Microbiol. 60: 78-85. Howell CR, Stipanovic RD (1980) Suppression of Pythium ultimum-induced
damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin. Phytopathology 70: 712-715.
Keel C, Schnider U, Maurhofer M, Voisard C, Laville J, Burger U, Wirthner P, Haas D, Defago G (1992) Suppression of root diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0: importance of the bacterial secondary metabolite 2,4- diacetylphloroglucinol. Mol. Plant Microbe In. 5: 4-13.
Kiely T, Donaldson D, Grube A (2004) Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates.
Kiprianova EA, Rabionvich AS (1969) Production of phenazine-1-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens. Mikrobiologiia 38: 224-7.
Kommedahl T, Chang-Mew IP (1975) Biocontrol of corn root infection in the field by seed treatment with antagonists. Phytopathology 65: 296-300.
Kraus J, Loper JE (1995) Characterization of a genomic region required for production of the antibiotic pyoluteorin by the biological control agent Pseudomonas fluorescens Pf-5. Appl Environ Microbiol 61: 849-854.
Lanteigne C, Gadkar VJ, Wallon T, Novinscak A, Filion M (2012) Production of DAPG and HCN by Pseudomonas sp. LBUM300 contributes to the biological control of bacterial canker of tomato. Phytopathology 102: 967- 73.
Larkin RP, Hopkins DL, and Martin FN (1993) Effect of successive watermelon plantings on Fusarium oxysporum and other microorganisms in soils suppressive and conducive to fusarium wilt of watermelon. Phytopathology
83: 1097-1105.
Lee JY, Moon SS, Hwang BK (2003) Isolation and in vitro and in vivo activity against Phytophthora capsici and Colletotrichum orbiculare of phenazine-1- carboxylic acid from Pseudomonas aeruginosa strain GC-B26. Pest Manag Sci 59: 872-82.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ligon J, Lam S, Gaffney T, Hill S, Hammer R, Torkewitz N (1996) Biocontrol: modifications for enhanced antifungal activity. Tacey G, Mullin B, Gresshoff P (eds) Biology of plant-microbe interactions. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions. St. Paul, Minn
Makarand RR, Prashant SD, Bhushan CL, Sudhir CB (2007) Detection, isolation and indentification of phenazine-1-carboxylic acid produced by biocontrol strains of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Scientific & Industrial Research 66: 627-631.
Mavrodi DV, Blankenfeldt W, Thomashow LS (2006) Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp. biosynthesis and regulation. Annu Rev Phytopathol 44
Mavrodi DV, Ksenzenko V, Chatuev B, Thomashow LS, Boronin AM (1997) Structural and functional organization of Pseudomonas fluorescens genes encoding enzymes of phenazine-1-carboxylic acid biosynthesis. Mol. Biol
31: 62-68.
Mavrodi DV, Ksenzenko VN, Bonsall RF, Cook RJ, Boronin AM, Thomashow LS (1998) A seven-gene locus for synthesis of phenazine-1-carboxylic acid by
Pseudomonas fluorescens 2-79. J Bacteriol 180: 2541-8.
Mussen E (1990) California crop pollination. Gleanings in Bee Culture 118: 646- 647.
Ogoshi A (1987) Ecology and phathogenicity of anastomosis and intraspecific groups of Rhizoctonia solani KUHN. Annual Reviews of Phytopathology 25: 125-43.
Pal'chykovs'ka LH, Aleksieieva IV, Kostina VH, Platonov MO, Nehruts'ka VV,