sau khi xử lí proteinase Kđối với nấm F. oxysporum (A, B) và R. solani (C, D) (A,C: 0,1 mg/ml proteinase K; B,D: 0,5 mg/ml Proteinase K; 1,2: Đĩa thí nghiệm; 3: Dịch không xử lý; 4: Đối chứng âm).
Công bố của Chythanya và cộng sự (2002) cho thấy dịch lọc từ chủng
Pseudomonas I-2 có khả năng chống các enzym proteolytic, lipolytic (Chythanya, Karunasagar, 2002). Quan và cộng sự công bố (2006) cho thấy dịch ngoại bào từ chủng Burkholderia CF-66 không bị ảnh hƣởng hoạt tính khi xử lý với proteinase K 0,1 mg/ml (Quan et al., 2006). Rattanachuay và cộng sự (2010) công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp. W3 đƣợc khảo sát với enzyme proteinase K 1 mg/ml, tripsin 2 mg/ml và một số enzyme khác kết quả cho thấy dịch lọc ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. W3 khá bền với các enzyme xử lý (Rattanachuay et al., 2010).
Nhƣ vậy, dịch chiết ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 khá bền ở nhiệt độ cao khi xử lý ở 100°C trong 10, 30, 60 và 90 phút, hoạt tính không bị mất vẫn còn duy trì đƣợc 86-97%. Bền ở dải pH từ 2-10. Proteinase K không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả đã công bố trên thế giới.
3.5 Tinh sạch hoạt chất thứ cấp ngoại bào ức chế nấm
3.5.1 Tách chiết và tinh sạch hoạt chất từ dịch nuôi cấy ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 Pseudomonas sp. ĐA3.1
Pseudomonas sp. ĐA3.1 đƣợc nuôi cấy trong bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng King’s B ở 30 C, lắc 200 vòng/phút, trong 5 ngày. Dịch nuôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cấy đƣợc li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Dịch loại bỏ tế bào chứa hợp chất ức chế nấm đƣợc lọc tiếp qua màng Minisart® (0,25 m, Satorius, Đức).
Dịch lọc qua màng đã loại bỏ hoàn toàn tế bào sau đó đƣợc chiết bằng dung môi ethyl acetate (1:1 v/v), thu pha dung môi, loại dung môi bằng máy cô quay chân không Buchi ở 40°C. Cặn cô quay đƣợc hòa trở lại bằng methanol (1/10 v/v), cặn cô quay tan trong methanol đƣợc cho chạy sắc kí (TLC) với hệ dung môi là chloroform và methanol (7:3 v/v), hiện băng dƣới đèn UV 256nm và xông hơi iodine (Hình 3.12A).
Dịch chiết đƣợc chạy sắc kí cột silicagel bằng hệ dung môi là chloroform và methanol với độ phân cực tăng dần. Kiểm tra hoạt tính các phân đoạn thu đƣợc sau khi tinh sạch qua cột silicagel theo phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch (Hình 3.12B), gom các phân đoạn có Rf giống nhau. Tiếp tục sắc kí cột silicagel lần 2 với phân đoạn có hoạt tính thu đƣợc trên, thu phân đoạn tinh sạch và kiểm tra độ sạch bằng TLC cũng nhƣ kiểm tra hoạt tính ức chế nấm của các phân đoạn thu đƣợc.
Kết quả ở Hình 3.12A cho thấy trên bản TLC đã thu đƣợc phân đoạn tinh sạch, không xuất hiện các băng phụ nhƣ mẫu dịch chiết cô quay, phân đoạn chứa hoạt chất tinh sạch đƣợc thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum ở hình 3.12B cho thấy các phân đoạn tinh sạch có hoạt tính ức chế nấm tốt với vòng vô khuẩn rõ ràng. Gom các phân đoạn sạch đem đi kết tinh thu tinh thể, phân tích cấu trúc và thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani.
A B
Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 (A) (1: hoạt chất tinh sạch, 2: dịch chiết). Thử hoạt tính ức chế F. oxysporum của các phân đoạn tinh sạch (B) (1: đối chứng nƣớc cất, 2: methanol, 3: dịch sau chiết, 4: dịch nuôi cấy; 5-7: các phân đoạn tinh sạch)