Để tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối ức chế mạnh nấm bệnh cây chúng tôi đã sử dụng các nguồn chủng vi khuẩn khác nhau. Các chủng vi khuẩn mới đƣợc phân lập từ đất, rễ, thân và lá thực vật ở các vùng Hƣng Yên, Thanh Oai, Đông Anh, Hòa Bình và Bắc Giang và nguồn chủng vi khuẩn có sẵn trong bộ sƣu tập của Phòng Vi sinh vật đất, Viện CNSH. Chúng tôi đã tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối ức chế F. oxysporum và R. solani theo các tiêu chí dựa trên phƣơng pháp Weller (Weller, 1988) (Hình 3.1).
A B
Hình 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn ức chế nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B)
Sau đó chủng đã đƣợc lựa chọn để kiểm tra lại khả năng đối ức chế các nấm bệnh cây theo phƣơng pháp đƣờng tròn đồng tâm.
Trong số các chủng tuyển chọn chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 có khả năng ức chế mạnh với cả hai loại nấm F. oxysporum (Hình 3.1A) và R. solani (Hình 3.1 B) thử nghiệm, chủng này đƣợc chúng tôi chọn làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Định tên chủng
Sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả hình 3.2A cho thấy DNA tƣơng đối sạch, không bị gãy và đủ chất lƣợng cho các nghiên cứu nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi 16S-F và 16S-R, sau khi điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose, sản phẩm thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 950 bp (hình 3.2B).
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc gắn vào vector pJET 1.2 và biến nạp vào tế bào
E. coli DH10b đã đƣợc tách plasmid. Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc lựa chọn (hình 3.2C) và và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và XhoI. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% xuất hiện hai băng DNA, một băng có kích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thƣớc khoảng 3000 bp tƣơng ứng với vector pJET1.2, băng còn lại có kích thƣớc khoảng 1000 bp tƣơng ứng với đoạn DNA chèn (hình 3.2.D).
A B C D
Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng Pseudomonas sp.ĐA3.1; Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc lựa chọn (C); Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (D). M: Marker.
Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA mong muốn đƣợc tách và tinh sạch để xác định trình tự nucleotide. Trình tự gen 16S rRNA của chủng Pseudomonas sp.
ĐA3.1 có độ tƣơng đồng 98% với các chủng P. aeruginosa trong GenBank có mã số tƣơng ứng HQ914782.1 và HM439411.1 (hình 3.3). Từ kết quả trên bƣớc đầu có thể kết luận chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 có độ tƣơng đồng cao với loài P. aeruginosa. Chúng tôi đã đăng ký trên GenBank chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 đƣợc phân lập ở Việt Nam với mã số là JN592444.1 (Đỗ Thị Tuyên et al., 2011).
Hình 3.3. Cây phân loại chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1(HQ914782.1: P. aeruginosa
strain TAUC7; HM597240.1: Pseudomonas sp. MB65; HM439411.1: P. aeruginosa strain PCP26; FN645730: P. aeruginosa)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn