Hoạt chất tinh sạch đƣợc xác định cấu trúc trên máy cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Đức). Các dữ liệu 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COYGP,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
HSQC, HMBC đƣợc thu thập, phân tích và so sánh với các dữ liệu đã công bố. Hoạt chất tinh sạch từ P. aeruginosa ĐA3.1 có đặc tính sau. Điểm nóng chảy: Mp = 241- 242°C, khối lƣợng phân tử: 240,218. Có tỷ lệ phần trăm thành phần: C 69,64%; H 3,60%; N 12,49%; O 14,27%. Mô tả vật lý của hoạt chất: tinh thể hình kim màu vàng xanh.
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 (CDCl3, 1 H: 500 MHz; 13C: 125,76 MHz) δppm. Cn° δC δH (J, Hz) 1 124.9 2 137.3 8.94 dd (7.0 and 1.5 Hz) 3 130.2 8.01 dd (9.0 and 7.0 Hz) 4 135.0 8.49 dd (9.0 and 1.5 Hz) 4a 143.3 5a 144.0 6 127.9 8.24 m 7 131.7 7.98 m 8 133.2 7.96 m 9 130.0 8.30 m 9a 139.7 10a 139.9 COOH 165.8 15.41 s
(s: singlet; d: doublet; dd: doublet of doublet; m: multiplet)
A B
Hình 3.13. Phổ 13
C (A) và phổ 1H (B) của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ chủng P.
aeruginosa ĐA3.1. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H – NMR ở vị trí C2 có δ = 8,94 ppm, ở vị trí C3 có δ = 8,01 ppm, ở vị trí C4 có δ = 8,49 ppm, ở vị trí C6 có δ = 8,24 ppm, ở vị trí C7 có δ = 7,98 ppm, ở vị trí C8 có δ = 7,96 ppm, ở vị trí C9 có δ = 8,30 ppm. Phổ 13 C-NMR (CDC1 3, 500MHz), δ (ppm): 124.9 (C-1); 137.3 (C-2); 130.2 (C-3); 135.0 (C-4); 143.3 (C-4a); 144.0 (C-5a); 127.9 (C-6); 131.7 (C-7); 133.2 (C-8); 130.0 (C-9); 139.7 (C-9a); 139.9 (C-10a); 165.8 (COOH). Dữ liệu C13-CPD,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DEPT-90, DEPT-135 cho biết phân tử này có 13 nguyên tố carbon trong đó có 7 nhóm CH và CH3 không có nhóm CH2.
So sánh với các tài liệu đã công bố trên thế giới chúng tôi thấy rằng dữ liệu phổ NMR cũng nhƣ cấu trúc hoạt chất chúng tôi tinh sạch đƣợc trùng khớp với hoạt chất phenazine-1-carboxyl axit (PCA) tinh sạch từ chủng P. fluorescens 2-79 do Mavrodi và cộng sự (1998) đã công bố (Hình 3.14) (Mavrodi et al., 1997; Mavrodi
et al., 1998).
Dữ liệu phổ NMR của hoạt chất từ chủng P.fluorescens 2-79 do Mavrodi và cộng sự (1998)
A B
C D
Hình 3.14. So sánh dữ liệu phổ NMR (A, B) và cấu tạo phân tử (C, D) của hoạt chất tinh sạch từ chủng P.fluorescens 2-79 (A), (C) và chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 (B), (D).
Dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Bảng 3.3) kết hợp với phổ DEPT, COYGP, HSBC, HMQC và công bố trên thế giới chúng tôi xác định hoạt chất tinh sạch đƣợc từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 là chất phenazine-1-carboxylic acid (PCA) hay có tên khác là tubermycin B có công thức phân tử C13H8N2O2 (Hình 3.15).
Hình 3.15. Cấu trúc phân tử của PCA tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1
Theo các công bố trên thế giới từ 90-95% các chủng Pseudomonas sản xuất các hợp chất phenazine (Smirnov, Kiprianova, 1990) và nhiều công bố cho thấy hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chất phenazine bao gồm các dẫn xuất có hoạt tính kháng nấm nhƣ phenazine-1- carboxylic axit (PCA), 1-hydroxy phenazine (1-OH-PHZ), và phenazine-1 - cacboxamit (PCN) (Budzikiewicz, 1993). Trong tự nhiên có hơn 100 cấu trúc các chất dẫn xuất khác nhau của phenazine đã đƣợc xác định và hơn 6000 hợp chất có chứa phenazine đã đƣợc tổng hợp (Mavrodi et al., 2006) và các chất chuyển hóa này đã đƣợc nghiên cứu sâu về các đặc tính kháng sinh phổ rộng, kháng nấm, kháng khuẩn và tác nhân điển hình khác (Kiprianova, Rabionvich, 1969; Ligon et al., 1996; Lee et al., 2003; Upadhyay, Srivastava, 2011).
Nhƣ vậy từ các thông số kỹ thuật trên, chúng tôi nghiên cứu và đƣa ra đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch đƣợc hoạt chất PCA, một hoạt chất có khả năng kháng nấm từ dịch nuôi cấy chủng P. aeruginosa ĐA3.1 phân lập tại Việt Nam. Chúng tôi đƣa ra quy trình (hình 3.16).
Hình 3.16. Qui trình tinh sạch hoạt chất PCA từ dịch nuôi cấy của Pseudomonas sp. ĐA3.1 phân lập ở Việt Nam
Chiết với ethyl acetate 2 giờ, theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:1. Cô quay
loại dung môi. Cao chiết
ethyl acetate
Hòa trong methanol, theo tỷ lệ 1:10 Dịch chiết MeOH
Tập trung các phân đoạn có hoạt chất tinh sạch; loại dung môi; kết tinh; sấy chân
không đến khô Sắc ký cột silicagel (hệ dung môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chloroform và methanol) Sản phẩm Phenazine-1-cacboxyl acid (PCA) (1) (2) (3) (4) Dịch lên men 5 ngày
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn