Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phƣơng pháp là E. coli đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các chuỗi DNA đi vào dễ dàng.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli đƣợc nuôi trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tiếp giống 1% vào môi trƣờng LB, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy đƣợc ủ lạnh trong đá 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 4000 vòng/phút ở 4°C trong 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phút thu tế bào. Tế bào đƣợc ủ lạnh trong đá lần 1 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 30 phút, ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút thu tế bào. Rửa lần 2 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 30 phút, ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút thu tế bào. Tế bào đã qua xử lý đƣợc hòa trong 50 l dung dịch 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp. Muốn sử dụng tế bào khả biến lâu dài, tế bào sau xử lý đƣợc hòa trong dung dịch 0,1 M CaCl2 chứa 15% glycerol bảo quản trong tủ -80°C có thể sử dụng trong 1 tháng đến 3 tháng.
Biến nạp plasmid vào E. coli: Lấy tế bào khả biến từ -80oC đặt ngay vào bình đá, để tan từ từ (trong khoảng 30 phút). Hút 5 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gene vào ống eppendorf chứa 50 µl dịch tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng rồi ủ trong đá khoảng 30 phút. Sau đó, hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 42°C trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt ngày vào đá trong 5 phút. Bổ sung 250 µl môi trƣờng LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung 0,1% ampicilin (100 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.