solani đƣợc nêu trong Bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 lên sinh trƣởng
của F. oxysporum Nồng độ dịch lọc (%) Sinh trƣởng của nấm(Ø: cm) Hoạt tính ức chế (%) Hình thái tản nấm
0 7,8 0 Sợi bông, màu tím nhạt
1 6,55 28 Sợi bông, màu tím đậm
10 2,60 88 Sợi bông, màu tím đậm
20 2,25 91 Sợi bông, màu tím đậm
50
1,80 93
Sợi bông, trắng-hồng nhạt
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 lên sinh trƣởng của sợi nấm R. solani
Nồng độ dịch lọc (%)
Sinh trƣởng của nấm*
(Ø: cm) Hoạt tính ức chế (%) Hình thái tản nấm
0 8,5 0 Sợi bông, màu trắng
1 5,85 50 Sợi bông, màu trắng
10 1,65 96 Sợi bông, màu trắng
20 1,00 98 Sợi bông, màu trắng
50 ≤0,5 100 Tàn lụi
3.4 Đánh giá tính chất lí hóa của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 ĐA3.1
3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 đƣợc xử lý ở 100°C với thời gian khác nhau, sau đó dịch đƣợc thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani theo phƣơng pháp ức chế nồng độ bổ sung.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử ý 90 phút ở 100° C vẫn giữ đƣợc 97% hoạt tính ức chế F. oxysporum và 98% hoạt tính ức chế
R. solani so với mẫu đối chứng không xử lí (100%) (Hình 3.6 và 3.7).
0 20 40 60 80 100 0 10 30 60 90 Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của chủng Pseudomonas
sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở các nhiệt độ sau 5 ngày nuôi cấy
10 30 10 30 0′ 0′
A 60 90 B 60 90 C D
Hình 3.7. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở 100°C đối với F. oxysporum và R. solani sau 5 ngày nuôi cấy. (A, C: F. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
oxysporum; B, D: R. solani; C: không xử lý; D: Đối chứng âm).
Theo báo cáo công bố trƣớc đây của Chythanya và cộng sự (2002) dịch lọc từ chủng Pseudomonas I-2 phân lập nhƣ là một nonproteinacious, sắc tố màu xanh hòa tan trong chloroform, chịu nhiệt độ có trọng lƣợng phân tử thấp (Chythanya, Karunasagar, 2002). Quan và cộng sự (2006) cho thấy dịch ngoại bào từ chủng
Burkholderia CF-66 có khả năng chịu đƣợc tác động của nhiệt độ 100°C trong 30 phút và 121°C trong 10 phút xử lý (Quan et al., 2006). Vijayan và cộng sự (2006) cho rằng dịch lọc ngoại bào từ chủng Pseudomonas PS-102 bền khi xử lý ở nhiệt độ 100°C và 121°C (Vijayana et al., 2006).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Rattanachuay và cộng sự (2010) công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp. W3 đƣợc khảo sát với nhiệt độ 50, 65, 75, 100 và 121°C trong 15 phút và 30 phút, kết quả thử nghiệm cho thấy dịch lọc ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. W3 bền với nhiệt độ, hoạt tính ức chế khuẩn vẫn giữ đƣợc từ 91-97% so với mẫu đối chứng không xử lý (100%) (Rattanachuay et al., 2010).
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi thấy dịch lọc ngoại bào từ chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 khá bền với nhiệt độ xử lý và kết quả nghiên cứu phù hợp với một số nghiên cứu công bố trên thế giới.
3.4.2 Ảnh hưởng của pH 0 20 40 60 80 100 2 4 8 10 pH xử lý Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani
Hình 3.8. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của dịch lọc ngoại bào
Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở các độ pH khác nhau
A 1 2 B 1 2 C 1 2 D 1 2
E 1 2 F 1 2 G 1 2 H 1 2
Hình 3.9. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí pH đối với F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) sau 5 ngày thử nghiệm. (A, E: pH 2; B, F: pH 4; C, G: pH 8; D, H: pH 10). 1: Môi trƣờng nuôi cấy ban đầu; 2: Dịch nuôi cấy.
Dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lý với pH từ 2 đến 10 và thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani theo phƣơng pháp ức chế nồng độ bổ sung. Kết quả thử nghiệm cho thấy khi xử lý với pH 2 hoạt tính ức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chế nấm F. oxysporum và R. solani của dịch lọc giảm nhẹ, vẫn giữ đƣợc 97% hoạt tính ức chế F. oxysporum và R. solani so với mẫu đối chứng không xử lý (100%). Ở pH 10 vẫn giữ đƣợc hoạt tính ức chế nấm thử nghiệm, hoạt tính tăng nhẹ so với mẫu đối chứng. Dịch lọc ngoại bào có khả năng giữ hoạt tính ở dải pH từ 2 đến 10 (Hình 3.8; Hình 3.9).
Theo công bố của Quan và cộng sự (2006) cho thấy hoạt tính ức chế nấm dịch ngoại bào từ chủng Burkholderia CF-66 khi xử lí với pH, hoạt tính của dịch ngoại bào bền ở dải pH từ 3 đến 11 (Quan et al., 2006). Rattanachuay và cộng sự (2010) công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp. W3 đƣợc khảo sát với pH từ 1 đến 10, kết quả thử nghiệm cho thấy dịch lọc từ chủng Pseudomonas sp. W3 bền với pH, hoạt tính ức chế vẫn duy trì đƣợc 92% ở pH 2 và 88% ở pH 10 so với mẫu đối chứng không xử lý (100%) (Rattanachuay et al., 2010). Từ kết quả trên cho thấy dịch lọc ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 giữ đƣợc hoạt tính ở dải pH khá rộng, từ đó ta thấy khả năng có thể sử dụng dịch lọc từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở nhiều điều kiện môi trƣờng có pH khác nhau để ức chế nấm Fusarium và
Rhizoctonia.
3.4.3 Ảnh hưởng của proteinase K
Dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lý với 0,1-0,5 mg/ml proteinase K vẫn giữ đƣợc 97-99% hoạt tính ức chế F. oxysporum, 98-99% hoạt tính ức chế R. solani so với mẫu đối chứng (100%) (Hình 3.10; Hình 3.11).
0 20 40 60 80 100 0 0,1 0,5 Nồng độ proteinase K (mg/ml) Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani
Hình 3.10. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của dịch lọc ngoại bào
Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí với proteinase K ở nồng độ khác nhau sau 5 ngày xử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 4 1 4 1 4 1 4
A 2 3 B 2 3 C 2 3 D 2 3
Hình 3.11. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch lọc ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí proteinase Kđối với nấm F. oxysporum (A, B) và R. solani (C, D) (A,C: 0,1 mg/ml proteinase K; B,D: 0,5 mg/ml Proteinase K; 1,2: Đĩa thí nghiệm; 3: Dịch không xử lý; 4: Đối chứng âm).
Công bố của Chythanya và cộng sự (2002) cho thấy dịch lọc từ chủng
Pseudomonas I-2 có khả năng chống các enzym proteolytic, lipolytic (Chythanya, Karunasagar, 2002). Quan và cộng sự công bố (2006) cho thấy dịch ngoại bào từ chủng Burkholderia CF-66 không bị ảnh hƣởng hoạt tính khi xử lý với proteinase K 0,1 mg/ml (Quan et al., 2006). Rattanachuay và cộng sự (2010) công bố dịch lọc chủng Pseudomonas sp. W3 đƣợc khảo sát với enzyme proteinase K 1 mg/ml, tripsin 2 mg/ml và một số enzyme khác kết quả cho thấy dịch lọc ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. W3 khá bền với các enzyme xử lý (Rattanachuay et al., 2010).
Nhƣ vậy, dịch chiết ngoại bào của chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 khá bền ở nhiệt độ cao khi xử lý ở 100°C trong 10, 30, 60 và 90 phút, hoạt tính không bị mất vẫn còn duy trì đƣợc 86-97%. Bền ở dải pH từ 2-10. Proteinase K không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả đã công bố trên thế giới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5 Tinh sạch hoạt chất thứ cấp ngoại bào ức chế nấm
3.5.1 Tách chiết và tinh sạch hoạt chất từ dịch nuôi cấy ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 Pseudomonas sp. ĐA3.1
Pseudomonas sp. ĐA3.1 đƣợc nuôi cấy trong bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng King’s B ở 30 C, lắc 200 vòng/phút, trong 5 ngày. Dịch nuôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cấy đƣợc li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Dịch loại bỏ tế bào chứa hợp chất ức chế nấm đƣợc lọc tiếp qua màng Minisart® (0,25 m, Satorius, Đức).
Dịch lọc qua màng đã loại bỏ hoàn toàn tế bào sau đó đƣợc chiết bằng dung môi ethyl acetate (1:1 v/v), thu pha dung môi, loại dung môi bằng máy cô quay chân không Buchi ở 40°C. Cặn cô quay đƣợc hòa trở lại bằng methanol (1/10 v/v), cặn cô quay tan trong methanol đƣợc cho chạy sắc kí (TLC) với hệ dung môi là chloroform và methanol (7:3 v/v), hiện băng dƣới đèn UV 256nm và xông hơi iodine (Hình 3.12A).
Dịch chiết đƣợc chạy sắc kí cột silicagel bằng hệ dung môi là chloroform và methanol với độ phân cực tăng dần. Kiểm tra hoạt tính các phân đoạn thu đƣợc sau khi tinh sạch qua cột silicagel theo phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch (Hình 3.12B), gom các phân đoạn có Rf giống nhau. Tiếp tục sắc kí cột silicagel lần 2 với phân đoạn có hoạt tính thu đƣợc trên, thu phân đoạn tinh sạch và kiểm tra độ sạch bằng TLC cũng nhƣ kiểm tra hoạt tính ức chế nấm của các phân đoạn thu đƣợc.
Kết quả ở Hình 3.12A cho thấy trên bản TLC đã thu đƣợc phân đoạn tinh sạch, không xuất hiện các băng phụ nhƣ mẫu dịch chiết cô quay, phân đoạn chứa hoạt chất tinh sạch đƣợc thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum ở hình 3.12B cho thấy các phân đoạn tinh sạch có hoạt tính ức chế nấm tốt với vòng vô khuẩn rõ ràng. Gom các phân đoạn sạch đem đi kết tinh thu tinh thể, phân tích cấu trúc và thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani.
A B
Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 (A) (1: hoạt chất tinh sạch, 2: dịch chiết). Thử hoạt tính ức chế F. oxysporum của các phân đoạn tinh sạch (B) (1: đối chứng nƣớc cất, 2: methanol, 3: dịch sau chiết, 4: dịch nuôi cấy; 5-7: các phân đoạn tinh sạch)
3.5.2 Xác định cấu trúc hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1
Hoạt chất tinh sạch đƣợc xác định cấu trúc trên máy cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Đức). Các dữ liệu 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COYGP,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
HSQC, HMBC đƣợc thu thập, phân tích và so sánh với các dữ liệu đã công bố. Hoạt chất tinh sạch từ P. aeruginosa ĐA3.1 có đặc tính sau. Điểm nóng chảy: Mp = 241- 242°C, khối lƣợng phân tử: 240,218. Có tỷ lệ phần trăm thành phần: C 69,64%; H 3,60%; N 12,49%; O 14,27%. Mô tả vật lý của hoạt chất: tinh thể hình kim màu vàng xanh.
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 (CDCl3, 1 H: 500 MHz; 13C: 125,76 MHz) δppm. Cn° δC δH (J, Hz) 1 124.9 2 137.3 8.94 dd (7.0 and 1.5 Hz) 3 130.2 8.01 dd (9.0 and 7.0 Hz) 4 135.0 8.49 dd (9.0 and 1.5 Hz) 4a 143.3 5a 144.0 6 127.9 8.24 m 7 131.7 7.98 m 8 133.2 7.96 m 9 130.0 8.30 m 9a 139.7 10a 139.9 COOH 165.8 15.41 s
(s: singlet; d: doublet; dd: doublet of doublet; m: multiplet)
A B
Hình 3.13. Phổ 13
C (A) và phổ 1H (B) của hoạt chất ức chế nấm tinh sạch từ chủng P.
aeruginosa ĐA3.1. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H – NMR ở vị trí C2 có δ = 8,94 ppm, ở vị trí C3 có δ = 8,01 ppm, ở vị trí C4 có δ = 8,49 ppm, ở vị trí C6 có δ = 8,24 ppm, ở vị trí C7 có δ = 7,98 ppm, ở vị trí C8 có δ = 7,96 ppm, ở vị trí C9 có δ = 8,30 ppm. Phổ 13 C-NMR (CDC1 3, 500MHz), δ (ppm): 124.9 (C-1); 137.3 (C-2); 130.2 (C-3); 135.0 (C-4); 143.3 (C-4a); 144.0 (C-5a); 127.9 (C-6); 131.7 (C-7); 133.2 (C-8); 130.0 (C-9); 139.7 (C-9a); 139.9 (C-10a); 165.8 (COOH). Dữ liệu C13-CPD,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DEPT-90, DEPT-135 cho biết phân tử này có 13 nguyên tố carbon trong đó có 7 nhóm CH và CH3 không có nhóm CH2.
So sánh với các tài liệu đã công bố trên thế giới chúng tôi thấy rằng dữ liệu phổ NMR cũng nhƣ cấu trúc hoạt chất chúng tôi tinh sạch đƣợc trùng khớp với hoạt chất phenazine-1-carboxyl axit (PCA) tinh sạch từ chủng P. fluorescens 2-79 do Mavrodi và cộng sự (1998) đã công bố (Hình 3.14) (Mavrodi et al., 1997; Mavrodi
et al., 1998).
Dữ liệu phổ NMR của hoạt chất từ chủng P.fluorescens 2-79 do Mavrodi và cộng sự (1998)
A B
C D
Hình 3.14. So sánh dữ liệu phổ NMR (A, B) và cấu tạo phân tử (C, D) của hoạt chất tinh sạch từ chủng P.fluorescens 2-79 (A), (C) và chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 (B), (D).
Dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR (Bảng 3.3) kết hợp với phổ DEPT, COYGP, HSBC, HMQC và công bố trên thế giới chúng tôi xác định hoạt chất tinh sạch đƣợc từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 là chất phenazine-1-carboxylic acid (PCA) hay có tên khác là tubermycin B có công thức phân tử C13H8N2O2 (Hình 3.15).
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.15. Cấu trúc phân tử của PCA tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1
Theo các công bố trên thế giới từ 90-95% các chủng Pseudomonas sản xuất các hợp chất phenazine (Smirnov, Kiprianova, 1990) và nhiều công bố cho thấy hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chất phenazine bao gồm các dẫn xuất có hoạt tính kháng nấm nhƣ phenazine-1- carboxylic axit (PCA), 1-hydroxy phenazine (1-OH-PHZ), và phenazine-1 - cacboxamit (PCN) (Budzikiewicz, 1993). Trong tự nhiên có hơn 100 cấu trúc các chất dẫn xuất khác nhau của phenazine đã đƣợc xác định và hơn 6000 hợp chất có chứa phenazine đã đƣợc tổng hợp (Mavrodi et al., 2006) và các chất chuyển hóa này đã đƣợc nghiên cứu sâu về các đặc tính kháng sinh phổ rộng, kháng nấm, kháng khuẩn và tác nhân điển hình khác (Kiprianova, Rabionvich, 1969; Ligon et al., 1996; Lee et al., 2003; Upadhyay, Srivastava, 2011).
Nhƣ vậy từ các thông số kỹ thuật trên, chúng tôi nghiên cứu và đƣa ra đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch đƣợc hoạt chất PCA, một hoạt chất có khả năng kháng nấm từ dịch nuôi cấy chủng P. aeruginosa ĐA3.1 phân lập tại Việt Nam. Chúng tôi đƣa ra quy trình (hình 3.16).
Hình 3.16. Qui trình tinh sạch hoạt chất PCA từ dịch nuôi cấy của Pseudomonas sp. ĐA3.1 phân lập ở Việt Nam
Chiết với ethyl acetate 2 giờ, theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:1. Cô quay
loại dung môi. Cao chiết
ethyl acetate
Hòa trong methanol, theo tỷ lệ 1:10 Dịch chiết MeOH
Tập trung các phân đoạn có hoạt chất tinh sạch; loại dung môi; kết tinh; sấy chân
không đến khô Sắc ký cột silicagel (hệ dung môi
chloroform và methanol) Sản phẩm Phenazine-1-cacboxyl acid (PCA) (1) (2) (3) (4) Dịch lên men 5 ngày
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.5.3 Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch
0 20 40 60 80 100 0 10 30 60 90 Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani 0 20 40 60 80 100 2 4 8 10 pH xử lý Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani A B 0 20 40 60 80 100 0 0,1 0,5 1,0 Nồng độ proteinase K (mg/ml) Hoạt tính ứ c ch ế (% ) F. oxysporum R. solani C
Hình 3.17. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh sạch sau khi xử lí với nhiệt độ (A), với pH khác nhau (B), với proteinase K (C)
A B C D
E F G H
Hình 3.18. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) của hoạt chất PCA tinh sạch xử lý với nhiệt độ (A, E), với pH khác nhau (B, C, F, G), với proteinase K (D, H) sau 5 ngày nuôi cấy.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hoạt chất PCA tinh sạch đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng nấm sau khi ủ ở nhiệt độ, pH và proteinase K, hoạt chất sau khi xử lý đƣợc đánh giá khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R. solani bằng phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.
Kết quả cho thấy hoạt chất PCA bền khi xử lý với các yếu tố lý hóa nhƣ nhiệt độ, pH và proteinase K (Hình 3.17 và Hình 3.18). Hoạt chất PCA đƣợc xử lý với nhiệt độ 100°C ở thời gian khác nhau hình 3.17A, sau một giờ xử lý hoạt tính giữ đƣợc 80-90% so với mẫu đối chứng. Ở pH 2 hoạt tính của hoạt chất PCA tăng nhẹ, pH 4 hoạt tính ức chế nấm của PCA giảm nhẹ, ở pH 10 hoạt chất PCA vẫn giữ trên 90% hoạt tính. Khi xử lý PCA với proteinase K ở nồng độ từ 0,1-1,0 mg/ml