được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng λ = 517nm.
• Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt
được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1µg/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở
370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở
bước sóng 517nm.
• Tính toán: % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
• Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học:
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ậ t độ q u a n g h ọ c ( O D)
(Thực hiện ở Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM
3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
Khi nghiên cứu loài Thông lá dẹt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ các cặn chiết từ mẫu lá và mẫu rễ của loài này trên sắc ký lớp mỏng. Kết quả cho thấy, sắc ký đồ của các cặn chiết của mẫu rễ cho nhiều vết rõ ràng hơn so với các cặn chiết của mẫu lá. Ngoài ra, khi tiến hành phân lập chất từ cặn chiết n-hexane của lá thì thu được β-sitosterol glucoside và β-sitosterol, hai chất thường gặp trong nhiều loài thực vật. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn mẫu rễ loài này để nghiên cứu kỹ hơn.
Sơđồ 3.1. Quy trình chiết rễThông lá dẹt
Dịch nước còn lại
Chiết với n- BuOH (3 lần) Dịch nước còn lại Dịch n-BuOH Cất loại dung môi Cặn n-BuOH (20g) Dịch nước còn lại
Chiết với EtOAc (3 lần)
Dịch EtOAc
Cất loại
dung môi Cặn EtOAc
(75g) Chiết với MeOH:Nước (80:20)
(4 lần) Dịch MeOH
Cất loại dung môi Dịch nước còn lại
Chiết với n-hexane (3 lần)
Dịch n-hexane
Cất loại
dung môi Cặn n-hexane
(3g)
Rễ loài Thông lá dẹt
Mẫu rễ Thông lá dẹt đã sấy khô (1,1kg), nghiền nhỏđược ngâm chiết bốn lần trong hỗn hợp MeOH/nước (80:20), ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi MeOH dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết phân lớp lần lượt với n- hexane,EtOAc và n-BuOH (mỗi loại chiết 1,5l x 3lần). Cất loại dung môi của các dịch chiết thu được dưới áp suất giảm thu được 3; 75 và 20g cặn các chiết tương
ứng (Sơđồ 3.1).