L ỜI CẢM ƠN
1.5. Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ ở Việt Nam
1.5.1. Nghiên cứu trên ngườị
Từ năm 2004-2006 bằng phương pháp xét nghiệm phân Kato-Katz và
lắng cặn cho cộng ựồng và phát hiện các ca bệnh ựã xác ựịnh cả nước có 24 tỉnh, thành có bệnh sán lá gan nhỏ lưu hành, trong ựó cao nhất là Nam định, Phú Yên (37%), Hà Nội (tỉ lệ nhiễm Hà Tây cũ là 40,1%)... và có 18 tỉnh,
thành có bệnh sán lá ruột nhỏ: Yên Bái, Phú Thọ, điện Biên, Lào cai, Bắc
Kạn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hà Tây (cũ), Nam định, Ninh Bình,
Thái Bình, Thanh Hóa, hải Phòng, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Lâm đồng và
An Giang với các loài sán lá ruột nhỏ ựược tìm thấy: Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, H.yokogawai, Centrocestus formosanus thuộc họ
Heterophyidae (Nguyễn Văn đề và Phạm Viết Khuê, 2009)
Nhiều nơi nuôi cá trực tiếp bằng phân người, phân gia súc. Vật chủ dự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
chủ dự trữ mầm bệnh ngoài chó, mèo còn có nhiều ựộng vật khác như gia cầm, chim tự nhiên nên sự phân bố của sán lá ruột nhỏ rất rộng rãị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
Bảng 1.8: Tỷ lệ nhiễm các loài sán lá ở trên ựộng vật nuôi ở Nam định (Anh và cs, 2009) Tỷ lệ nhiễm (%) Loài sán lá Chó (n=25) Mèo (n=20) Lợn (n=4) H.pumilio 84 100 100 H.taichui 16 25 50 C.formosanus 4 5 C.sinensis 8 5
Nam định là một trong những khu vực ựặc hữu ở phắa Bắc ỜViệt Nam
mà sán lá truyền qua cá gây bệnh ở người có tỷ lệ nhiễm cao ở người (Nguyễn Văn đề và Lê Thị Hoa, 2011) chó, mèo (Anh và cs, 2009)
Bảng 1.9: Tỷ lệ nhiễm các loài sán lá ở trên ựộng vật nuôi ở Nghệ An. (Anh và cs, 2009) Tỷ lệ nhiễm (%) Loài sán lá Chó (n=27) Mèo (n=18) Lợn (n=5) H.pumilio 92,6 100,0 100,0 H.taichui 62,9 77,8 60,0 C.formosanus 11,1 5,6
Tỷ lệ nhiễm các loài sán lá trên chó, mèo lợn ở Nghệ An rất cao (bảng 1.9) cho thấy vật nuôi trong nhà cũng là vật chủ ựối với FZT, chắnh vì vậy cần
phải ựược ựưa vào các chương trình kiểm soát ngăn ngừa lây nhiễm FZT trên người (Anh và cs, 2009)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
1.5.2. Nghiên cứu trên cá.
Phạm Cử Thiện và ctv ựã ựiều tra khảo sát về sự lây nhiễm sán lá gây bệnh ở người có nguồn gốc thủy sản (Fishborne Zoonotic Trematode - FZT) trên cá trê lai và cá tai tượng ựã ựược thực hiện ở ựồng bằng sông Cửu Long, tập trung vào các hệ thống nuôi ghép và nuôi kết hợp trong hệ thống vườn - ao - chuồng (VAC), trong ựó có phân tắch hiện trạng sử dụng phân chuồng làm thức ăn cho cá. Các mẫu cá ựã ựược thu trong cả mùa mưa và mùa khô. Kết quả cho thấy metacercariae FZT không có trong cá trê lai nuôi ựơn, tuy vậy lại rất phổ biến ở cá nuôi thuộc hệ thống VAC. Metacercariae sán lá thuộc họ
Heterophyidae: Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Centrocestus formosanus
và Stellantchasmus falcatus, với tỷ lệ nhiễm như sau: 1,7% ở cá tai tượng nuôi
ựơn; 6,6% trong cá chép nuôi ghép và 3,0% trong nuôi hệ thống VAC.
Haplorchis pumilio là loài sán phổ biến nhất, chiếm trên 58,0% ấu trùng metacercariae phát hiện ựược ở cá. Cường ựộ nhiễm mạnh nhất là ở cá chép nuôi ghép, ựặc biệt trong mùa mưa lũ. Kết quả cho thấy một số hệ thống nuôi cá ựang tồn tại những rủi ro về FZT (Thien và cs, 2007)
Nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Hùng và cs (2008) nhằm xác ựịnh mối liên hệ giữa sự nhiễm ấu trùng sán lá ruột ở trong ốc và cá ở các ao cá giống
ựã cho thấy: Cá bột không bị nhiễm FZT. Không có quan hệ rõ ràng giữa mật
ựộ của các loài ốc nhiễm ấu trùng sán lá ruột và tỷ lệ hay cường ựộ nhiễm ấu trùng metacercariae ở cá. Mặc dù tỷ lệ và cường ựộ nhiễm ở cá cao hơn ốc nhiễm trong ao, không thu ựược ốc có nhiễm ấu trùng trong ao, nhưng rõ ràng sự lây nhiễm vẫn rất cao khi không tìm thấy ốc bị nhiễm ấu trùng. Có thể sẽ
cần những nỗ lực nghiêm khắc hơn ựể kiểm tra ấu trùng có trong ốc tại những ao này hoặc xác ựịnh tại sao một lượng lớn ấu trùng cercariae vào ựược aọ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24
Có thể nguồn gốc của ấu trùng và những công việc liên quan ựến vấn ựề kiểm soát sẽựược bàn luận (Nguyễn Mạnh Hùng và cs, 2009).
Tại Nghệ An, ựiều tra trên các ựối tượng gồm trắm cỏ, chép, mè trắng, trôi, rô phi và các loài cá tạp trong ao thu ựược ngẫu nhiên từ quá trình ựánh bắt những loài cá trên thì kết quả thu ựược về tỷ lệ nhiễm lần lượt là 62,8%, 54,3%,40%, 36%, 11,8%, 75% các loại metacercariae của sán lá ruột nhỏ, với số lượng cao nhất là 3.163 metacercariae/1 cá thể. Thành phần các loài metacercariae ựược tìm thấy bao gồm: Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Haplorchis yokogawai, Centrocestus fomosanus và Echinostoma japonicus, trong ựó tỷ lệ nhiễm metacercariae của H. pumilio cao nhất, lên tới 42,06% (Chi và cs, 2008). Năm 2007 khi xét nghiệm 4 loài cá chủ yếu (cá mè, cá chép, cá trắm, cá rô phi) nuôi tại hồ Thanh Trì (Hà Nội) và hồ Vị Xuyên (Nam định) cho thấy, vào thời ựiểm lúc mới nuôi, cả 2 hồ ựều chỉ tìm thấy cá chép nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ với tỷ lệ thấp. Ấu trùng ở cả 2 ựiểm ựều
ựược xác ựịnh là H. pumilio. Vào thời ựiểm thu hoạch (sau 7 tháng) cả 4 loài cá nuôi chủ yếu trên ựều ựược xét nghiệm ựều nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ. Thành phần loài của ấu trùng thu ựược là H. pumilio và C. formosanus ở hồ
Thanh Trì; H. pumilio và H. taichuiở hồ Vị Xuyên (Nguyễn Văn đề và Nguyễn
Thị Hợp, 2007).
Cũng vào thời gian ựó, qua nghiên cứu tại Ninh Bình trên 3 loài cá nuôi là cá mè trắng, cá trắm cỏ, cá rôhu, Nguyễn Thị Thanh (2007) ựã phát hiện 5 loài metacercariae, trong ựó có 4 loài sán lá ruột nhỏ là Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Centrocestus formosanus, Procerovum sp. và một loài sán lá gan là Clonorchis sinensis. Ở cá hương và cá giống của cả 3 loài nghiên cứu
ựều nhiễm nhiều nhất là H. pumilio ký sinh ở cơ và C. formosanus ký sinh ở
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
như H. taichui, Procerovum sp. chỉ tìm thấy ở cơ cá trắm cỏ. Còn sán lá gan chỉ phát hiện ở cơ cá trắm cỏ với mức ựộ nhiễm không cao (Nguyễn Thị
Thanh, 2007)
Tại 4 tỉnh đồng bằng sông Mêkông, nghiên cứu của đinh Thị Thủy và ctv (2010) ựã ghi nhận sự xuất hiện của 4 loài sán lá có khả năng lây nhiễm cho người ở cá trạ Tổng số 1.127 mẫu cá ựược thu từ các ao nuôi bao gồm hệ nuôi nông hộ (Farm House System - FHS) (279) và hệ thống nuôi trang trại (Farm House Hold Systems - FHHS) (848) ựược kiểm tra bằng các phương pháp cổ ựiển và sinh học phân tử. Các loại ấu trùng sán Haplorchis pumilio, H. taichui, Centrocestus formosanus và Procerovum sp. ựược phát hiện và phân tắch trong mối quan hệ với mùa vụ, phương thức quản lý, kắch cỡ vật chủ, vị trắ nhiễm. Nói chung, tỷ lệ nhiễm ở cá cao hơn vào mùa mưa từ tháng 4 ựến 10 so với mùa khô. Tỷ lệ nhiễm và cường ựộ nhiễm thấp hơn với cá nuôi trong hệ thống FHHS so với FHS. Cá ở các ựộ tuổi từ 60 ựến 90 ngày có tỷ lệ nhiễm cao nhất, phản ánh sự có mặt của mối nguy lây nhiễm luôn luôn thường trực trong ao cá sau khi thả giống. Ký sinh trùng ựược phát hiện ở
phần cơ, ựầu và vây; ựặc biệt là các gốc vâỵ Tầm quan trọng của cá tra hiện nay ựang gia tăng cả ở thị trường trong nước, quốc tế và các phương pháp quản lý trong trang trại nuôi và công nghệ chế biến có thể giảm thiểu mức ựộ
rủi ro từựó cải thiện ựược tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm cá tra (Thuy và cs, 2010)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
Chương 2 Ờ NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứụ
Phân lập ấu trùng của các loài sán lá gây bệnh cho con người trên một số loài cá tự nhiên thu ựược tại Nam định và Ninh Bình.
định loại ấu trùng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ gây bệnh cho con người nhiễm trên cá tự nhiên thu ựược tại Nam định và Ninh Bình.
Nghiên cứu sự phân bố của ấu trùng sán lá gan nhỏ gây bệnh cho người trên cá nhiễm
2.2. Thời gian, ựịa ựiểm nghiên cứụ
2.2.1. Thời gian nghiên cứụ
Thực hiện từ ngày 04/2012 ựến tháng 4/2013
2.2.2. địa ựiểm nghiên cứụ
địa ựiểm thu mẫu: tỉnh Nam định, tỉnh Ninh Bình.
địa ựiểm phân tắch mẫu bệnh: Phòng bệnh cá Ờ trung tâm nghiên cứu Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Bắc Ờ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứụ
2.3.1. Phương pháp thu mẫụ
Tại Nam định dùng vợt, dùng riu ựể thu những mẫu cá tự nhiên ngoài kênh, mương nhỏ gần khu vực dân cư. Thu 3 ựợt mẫu vào các tháng 5,6,9.
Tại Ninh Bình cá tự nhiên ựược thu mua ngoài chợ. Mẫu cá ựược thu từ
tháng 5 ựến tháng 11.
Các mẫu cá tự nhiên thu ựược cho vào túi bóng, ghi nhãn lại cẩn thận
và ựược cho vào thùng xốp có ựá lạnh. Sau ựó những mẫu này ựược ựem về
Phòng bệnh Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh Ờ Viện 1 ựể phân tắch.
Hệ thống phân loại các loài cá tự nhiên dựa theo sách Cá nước ngọt Việt Nam do Nguyễn Văn Hảo làm chủ biên (Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ
Vân, 2001).
2.3.2. Phân lập ấu trùng sán lá trên 1 loài cá tự nhiên.
Vật liệu:
Nghiên cứu ựược tiến hành từ 4/2012 Ờ 11/2012 ở hai tỉnh Nam định, Ninh Bình. Trong thời gian thực hiện ựề tài tiến hành thu mẫu ựược 6 loài cá
tự nhiên.
Tại Nam định thu ựược tổng số 370 mẫu cá của 4 loài cá tự nhiên. Ninh Bình thu ựược 482 mẫu cá của 5 loài cá tự nhiên ựược sử dụng làm vật liệu của nghiên cứu này (Bảng 2.1 ). Bảng 2.1: Thành phần loài cá và số mẫu kiểm trạ Số mẫu kiểm tra (con) STT Loài cá Nam định Ninh Bình Tổng số mẫu 1 Cá mương Hemiculter leucisculus 171 268 449
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
2 Chày mắt ựỏSqualiobarbus curriculus 28 25 53 3 Cá diếc Carassius auratus 124 112 236 4 Cá rô ựồng Anabas testudineus 47 47 5 Cálành canh Parachela oxygastroides 45 45 6 Cá thiểu Culter flavipinnis 32 32
Tổng số mẫu 370 482
Phương pháp tiêu cơ:
Áp dụng theo Sổ tay phòng thắ nghiệm dự án FIBOZOPA - FIBOZOPA Lab manual, 2005
Pha dung dịch tiêu cơ gồm 6 gam pepsin và 8 ml HCl ựặc pha trong 1 lắt nước cất.
Phân loại loài cá
Cân, ựo kắch thước từng cá thể cá. Nghiền nhỏ từng cá thể cá.
Trộn phần ựã nghiền với dung dịch tiêu cơ sau ựó khuấy ựềụ
đặt trong tủấm 37oC trong 2-3 giờ.
Khi cơ tan hết tiến hành lọc: ựổ sản phẩm tiêu cơ qua lưới lọc có mắt lưới (1 x1) mm và rửa bằng nước muối sinh lý 0,86%.
để lắng hỗn hợp trong vài phút, các bào nang metacercariae nặng sẽ
lắng chìm xuống dưới, loại bỏ phần nước nổi bên trên, giữ lại phần lắng cặn.
đưa phần lắng cặn vào ựĩa petri chứa nước muối sinh lý 0,86%, xoay nhẹ ựĩa cho các chất lắng cặn tập trung vào giữa ựĩa petri, dùng pipet loại bỏ
phần nhẹ nổi trên mặt.
Quan sát trên kắnh hiển vi soi nổi ựểựếm số lượng metacercariaẹ
Chuyển metacercariae sang lam kắnh, nhỏ một giọt nước muối sinh lý, quan sát hình thái chi tiết dưới kắnh hiển vi 4x10, 10x10, 40x10.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
2.3.3. định loại ấu trùng sán.
Phương pháp:
Dựa vào hình thái ấu trùng sán
Theo khóa phân loại ựược mô tả trong sổ tay phòng thắ nghiệm của dự
án FIBOZOPA
để phân loại ựược metacercaria, dựa vào ựặc ựiểm hình thái thu riêng những ấu trùng có hình dạng tương tự vào trong các ựĩa petri nhỏ.
Chuyển metacercaria sang lam kắnh, nhỏ một giọt nước muối sinh lý
0,86% ựậy lamen và quan sát hình thái chi tiết dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng
ựại theo cấp ựộ tăng dần 4x10, 10x10, 40x10. Kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại
phù hợp nhất ựể có thể ựịnh loại là 40x10.
đặc ựiểm chắnh sử dụng trong việc phân loại metacercariae như sau:
Giác miệng, giác bụng và tuyến xâm nhập.
Hầu, thực quản và ruột.
Tế bào lửa, túi bài tiết và lỗ bài tiết.
Mần sinh dục: tinh hoàn, buồng trứng, chất noãn hoàng, gonotyl, ống sinh dục và cơ quan tiếp nhận. Giác miệng Giác bụng Ruột Hầu Thành nang Túi bài tiết
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Gai miệng, vỏ gai và stylets Phá nang ấu trùng metacercariae
Thường rất khó xác ựịnh ựến mức giống của ấu trùng metacercaria trong khi chúng vẫn ở dạng nang. Ép metacercaria giải phóng khỏi nang trứng ra ngoài, việc này có thể làm tăng khả năng quan sát các ựặc ựiểm hình thái,
ựặc biệt những ựặc ựiểm ựược mô tả dưới ựây, những ựặc ựiểm quan trọng trong phân loạị
Cách ựơn giản có thể thực hiện ựể phá nang ấu trùng metacercariae là ép cơ học. đôi khi ép rất nhẹ nang metacercaria dưới lam men với nước hoặc nước muối sinh lý có thể làm vỡ ựược nang của metacercariae hoặc có thể
làm vỡ nang với ựầu kim nhỏ thao tác dưới kắnh hiển vị
Gây nhiễm ựộng vật
Với một số trường hợp không thể ựịnh loại dựa vào hình thái ấu trùng thì cần gây nhiễm cho ựộng vật. Trong nghiên cứu này, ấu trùng metacercaria
của sán lá gan nhỏ C. sinensis thu trên cá mương Hemiculter leucisculus ựã
ựược gây nhiễm trên mèọ Việc gây nhiễm ựộng vật ựể xác nhận ấu trùng sán
lá gan nhỏ C. sinensis là cần thiết bởi giai ựoạn này không thể phân biệt ựược
ấu trùng sán lá gan C. sinensis và Ọ viverrini. Sán lá gan nhỏ trưởng thành có
thể phân biệt nhờ vào hình thái của tinh hoàn: C. sinensis có hình rễ cây trong khi tinh hoàn của Ọ viverrini phân thùỵ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
Hình 2.1: Ấu trùng metacercariae của sán lá gan nhỏ C.sinensis
gây nhiễm cho mèo non
Mèo ựược chọn làm thắ nghiệm là mèo non ựãăn ựược cơm, mèo ựược
khoảng 1 tháng tuổị
Metacercariae ựược gây nhiễm cho mèo với liều 20 ấu trùng/mèọ
Kĩ thuật gây nhiễm mèo non (Dựa theo kĩ thuật gây nhiễm trên chuột
của Helle Kay và ctv, 2008)
Sử dụng kim gây nhiễm ựầu tròn lấy ấu trùng sán Clonorchis sinensis sau khi phân lập ựược từ cá.
Tay phải cầm kim có chứa ấu trùng sán, tay trái giữ mèo; ngón trỏ và ngón cái cầm chắc vào da phần gáy của mèo, ngón út kẹp chặt lấy ựuôi mèọ
Kéo nhẹ phắa ựầu mèo giữ chặt cốựịnh phắa ựuôi ựể sao cho mèo
ở tư thế thẳng nhất.
đưa nhẹ ựầu kim gây nhiễm vào miệng mèo, luồn qua hầu, thực quản ựến dạ dày và bơm hết dung dịch chứa metacercariae ra khỏi xi lanh.
Theo chu kì phát triển của sán lá gan nhỏ thì thời gian từ khi ăn phải ấu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp
ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
ngàỵ Chắnh vì vậy sau 4 -5 tuần gây nhiễm, mèo sẽ ựược mổ ựể thu sán trưởng thành:
+ Mèo ựược gây mê bằng dung dịch ete trong cốc thủy tinh có chứa bông.
+ Mổ lấy toàn bộ gan của mèo và ựể trong ựĩa petri có chứa nước