Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Kỹ thuật phân tích
2.3.5.1. Kỹ thuật xác định kháng sinh nhóm tetracylin [26], [27].
a. Nguyên lý của phương pháp
Các KS này trong mẫu đƣợc chiết tách bằng dung dịch đệm (pH =4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lƣợng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
* Chuẩn bị mẫu phân tích
- Cân khoảng 5 g mẫu cho vào ống ly tâm 1;
- Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền;
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, gạn dịch trong của ống ly tâm 1 sang ống ly tâm 2;
- Thêm tiếp 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm 1, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, gạn dịch sang ống ly tâm 2;
- Ly tâm ống 2 với tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút, lọc gạn lấy dịch phía trên qua phễu Bucher;
- Rửa ống ly tâm 2 lần với 4 ml dụng McIlvaine –EDTA;
- Làm sạch dịch ly tâm qua cột chiết pha rắn Sep-pak;
- Thu dịch qua cột vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch;
- Làm giầu mẫu;
- Dung dịch thu đƣợc mang đi phân tích trên thiết bị HPLC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng đƣợc định nghĩa là mẫu đã đƣợc xác định không có các KS thuộc nhóm tetracyline. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống nhƣ chuẩn bị với mẫu thử.
* Ðiều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Cột sắc ký : Cột pha đảo Sep - Pak Cartrige C18, L x ID : 250 x 4,6 mm;
- Nhiệt độ cột: 280C;
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút;
- Bước sóng: 350 nm;
- Thể tích bơm mẫu: 60 l.
* Tính toán kết quả
Hàm lượng các KS có trong mẫu được tính dựa trên đường chuẩn. Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các KS có trong mẫu được tính theo công thức sau:
Trong đó: X: Hàm lƣợng KS trong mẫu (mg/kg);
C: Nồng độ KS trong dịch chạy máy;
V: Thể tích dung dịch cuối;
m: Khối lƣợng của mẫu phân tích;
k: Hệ số pha loãng.
2.3.5.2. Kỹ thuật xác định hormone nhóm - agonist [28], [29].
* Nguyên lý: Dƣ lƣợng clenbuterol và ractopamine tự do mẫu đƣợc chiết bằng hỗn hợp axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorit, natri sunphat và magiê sunphate để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết mẫu.
Dịch chiết đƣợc làm bay hơi dung môi đến khô, phần cặn hòa tan bằng dung dịch nước chứa 10% axetonitril, làm sạch bằng n-hexan và đưa vào phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để xác định và định lƣợng clenbutarol và ractopamine có trong mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
* Chuẩn bị mẫu thử
- Cân mẫu đã nghiền nhỏ cho vào ống nghiệm;
- Cho 4 ml axetonitril và 1ml isopropanol vào các ống nghiệm chứa mẫu;
- Trộn đều bằng máy lắc trong 2 phút;
- Thêm vào mỗi ống 1,2 g NaCl, lắc mạnh 2 phút;
- Thêm vào mỗi ống 4 g Na2SO4 và 0,5 g MgSO4, lắc đều 2 phút trên máy lắc;
- Ly tâm 4 phút ở tốc độ 4000 vòng / phút;
- Chuyển 1 ml lớp trên sang ống nghiệm thuỷ tinh;
- Thổi khô bằng N2 ở nhiệt độ 40 C;
- Hoà tan mẫu bằng 1 ml dung dịch 10% axetonitril trong nước;
- Phân tích trên HPLC.
* Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng là mẫu không có HM, các bước chuẩn bị như mẫu thử.
* Điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao - Cột C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 m);
- Nhiệt độ cột 40oC;
- Detector PDA ở 2 bước sóng 210 nm và 266 nm;
- Tốc độ dòng 0,2 ml/phút;
- Thời gian chạy 12 phút;
- Pha động: theo gradient nồng độ.
* Tính kết quả
Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa chiều cao peak và nồng độ, căn cứ vào diện tích peak mẫu tính kết quả theo công thức sau.
V V V C
m
x K
2 1
X 3
Trong đó:
X: là nồng độ của từng loại β-agonist có trong mẫu, tính bằng μg/kg;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cx: là nồng độ clenbuterol đo được suy ra từ đường chuẩn, μg/l;
V1: là thể tích ban đầu mà chất phân tích có mặt trong đó, tính bằng ml;
V2: là thể tích dịch trích mang đi phân tích, tính bằng ml;
V3: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;
k: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, k = 1);
m: là khối lƣợng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/