Helrick (1997) cho biết, hệ vi khuẩn hiếu khí ô nhiễm thực phẩm được hiểu bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, chúng xuất phát từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Thông qua việc xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khi cho phép sơ bộ nhận định tổng quan chung về tình trạng vệ sinh thực phẩm. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí được xem là phương pháp tốt nhất để ước lượng số
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 vi khuẩn xâm nhập vào thực phẩm.
Avery (2000) cho biết, hệ vi khuẩn có mặt trong thịt được chia thành hai nhóm, dựa theo mức độ và điều kiện phát triển của chúng gồm:
Nhóm vi khuẩn ưa nhiệt phát triển tốt nhất ở 370C và ngừng phát triển ở nhiệt độ thấp khoảng 10C. Vi khuẩn ưa nhiệt có thể xâm nhập vào thân thịt ngay sau khi giết mổ, bởi vậy cần kiểm tra nhóm vi khuẩn ưa nhiệt ở nhiệt độ nuôi cấy từ 350C – 370C (Herbert, 1991).
Nhóm vi khuẩn ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ thấp hơn. Tuy nhiên, sự phân nhóm này chỉ có ý nghĩa tương đối.
Ingram và Simonsen (1980) cho rằng vi khuẩn ưa lạnh có thể phát triển trong phạm vi nhiệt độ từ 00C – 300C, song nhiệt độ tối ưu là 100C – 150C. Morita (1975) cho rằng vi khuẩn nhóm này phát triển ở nhiệt độ thấp hơn, chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 00C nhưng không sinh trưởng và phát triển được ở nhiệt độ 200C, nhiệt độ tối ưu đối với vi khuẩn này là 00C – 150C hoặc thấp hơn. Grau F. H et al. (1986) lại cho rằng, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển vi khuẩn ưa lạnh là 200C, chúng khó phát triển ở nhiệt độ 350C – 370C.
Theo TCVN 4884: 2005, nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm có thể áp dụng cho mọi vùng là 300C.
Chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có ý nghĩa đánh giá sơ bộ chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. Tuy nhiên, không thể đánh giá rằng tổng số vi khuẩn ở mức độ thấp có nghĩa là sản phẩm an toàn. Trong một số trường hợp, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí thấp nhưng chứa độc tố gây ngộ độc của vi khuẩn, ví dụ như độc tố enterotoxin của S. aureus. Hay trong trường hợp thực phẩm lên men không thể đánh giá chất lượng vệ sinh theo tiêu chí này, vì bản chất tự nhiên của sản phẩm chứa rất nhiều tế bào vi khuẩn sống, sự lên men được tạo ra do hoạt động của các vi khuẩn lên men.
1.4.2. Coliforms
Colifoms là những trực khuẩn gram âm không sinh nha bào, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 - 48
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 giờ. Nhóm Colifoms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật.
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms trong thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao.
1.4.3. Escherichia coli (E. coli)
Escherichia thường xuất hiện rất sớm ở đường ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ), chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trường hợp còn tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau của cơ thể.
1.4.3.1. Những đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Escherichia coli
* Đặc tính hình thái
E. coli là một trực khuẩn hỡnh gậy ngắn, kớch thước 2 – 3 x 0,6àm. Trong cơ thể có hình trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong mụi trường nuụi cấy thấy cú những trực khuẩn dài 4 – 8 àm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhưng một số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
* Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn Escherichia coli dễ dàng phát triển ở các môi trường dinh dưỡng thông thường, là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển là 370C, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50C – 400C và pH thích hợp 7,2 - 7,4, nhưng có thể phát triển trong môi trường pH 5,5 - 8.
- Nuôi cấy trong môi trường nước thịt: E. coli phát triển nhanh, môi trường đục đều có cặn màu tro nhạt, trên mặt hình thành màng mỏng dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối.
- Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ vi khuẩn E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2-3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc trở thành màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy có cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (mucoide).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 - Trên môi trường Endo: Hình thành khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim.
- Trên môi trường S.S: E. coli có khuẩn lạc màu hồng hoặc đỏ cánh sen.
- Trên môi trường MacConkey: Sau 24 giờ vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc màu đỏ.
* Đặc tính sinh hoá
Các chủng E. coli đều lên men sinh hơi mạnh glucose, lactose. Lên men không sinh hơi saccarose, rafinose, salixin và glyxerol. E. coli di động, có sinh Indol, không sinh ureaza, có men lysindecacboxylaza, không sinh H2S và sử dụng citrat.
1.4.3.2. Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng của vi khuẩn Escherichia coli
* Đặc tính gây bệnh
E. coli sống ký sinh trong đường ruột với tỷ lệ cao (80-100%) so với các vi khuẩn hiếu khí khác và là tác nhân gây bệnh có điều kiện vì bình thường vi khuẩn cư trú trong ruột mà không gây bệnh. E. coli trở thành gây bệnh khi chúng phát triển nhân lên chiếm ưu thế trong hệ vi khuẩn đường ruột bằng yếu tố cạnh tranh và tiếp nhận được các yếu tố gây bệnh (Lê Văn Tạo, 2006).
Reid (1991) cho rằng, sự có mặt của E. coli trong thực phẩm được coi như yếu tố chỉ ra nhiễm phân. Vì thế E. coli được xem là yếu tố chỉ điểm tình trạng vệ sinh trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự có mặt số lượng lớn vi khuẩn E. coli trong thực phẩm, đặc biệt là thịt tươi có thể không liên quan trực tiếp đến sự có mặt của các vi khuẩn gây bệnh. Nhưng sự nhiễm với số lượng lớn báo hiệu mối nguy hiểm lớn về khả năng gây bệnh.
* Sức đề kháng
E. coli không chịu được nhiệt độ, đun 550C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, đun sôi 1000C chết ngay. Các chất sát trùng thông thường: acid phenic, biclorua thủy ngân, formol, hydroperoxit 1% diệt vi khuẩn sau 5 phút. Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài, các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng.
1.4.3.3. Độc tố - yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli sản sinh 2 loại độc tố: Nội độc tố và ngoại độc tố.
- Ngoại độc tố là một chất không chịu nhiệt, dễ bị phá huỷ ở 560C trong vòng 10 – 30 phút. Dưới tác dụng của formol và nhiệt độ cao, ngoại độc tố chuyển thành
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 giải độc tố. Ngoại độc tố có hướng thần kinh và gây hoại tử. Hiện nay, việc chiết xuất ngoại độc tố chưa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập.
- Nội độc tố là yếu tố gây độc chủ yếu của trực khuẩn đường ruột. Chúng có trong tế bào vi khuẩn và gắn với tế bào vi khuẩn rất chặt. Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phương pháp như phá vỡ vỏ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axit trichloaxetic, phenol, dưới tác dụng của enzyme. Nội độc tố được coi là kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng vi khuẩn.
Hiện nay, khi nghiên cứu về độc tố do E. coli sinh ra, người ta thường chú ý đến hai lớp độc tố đường ruột chủ yếu là:
+ Độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin): Độc tố này chịu được nhiệt 1200C trong vòng 1 giờ và bền vững ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở 200C), nhưng bị phá huỷ nhanh chóng khi hấp cao áp.
+ Độc tố không chịu nhiệt HT (Heat-Labile Toxin): Độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút.
1.4.4. Salmonella
1.4.4.1. Những đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella
* Đặc tính hình thái
Salmonella là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 àm, khụng hỡnh thành giỏp mụ và nha bào. Đa số cỏc loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có từ 7 – 12 lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum - pullorum) vi khuẩn dễ nhuộm với thuốc nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt mầu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu.
* Đặc tính nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy.
Nhiệt độ nuôi cấy là 370C, nhưng có thể phát triển được ở nhiệt độ 6 – 420C. Nuôi cấy ở 430C có thể loại trừ được tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển được. pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6 tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6 – 9.
- Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường nước thịt: Cấy vài giờ đã đục nhẹ,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 sau 18 giờ đục đều, nuôi lâu ở đáy ống nghiệm có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng.
- Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch thường: Vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của E. coli (đường kính 1 – 1,5 mm).
- Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhãn bong.
- Môi trường thạch Endo: Vi khuẩn Salmonella hình thành khuẩn lạc màu trắng hồng, tròn trơn, nhẵn bóng trông như những hạt sương long lanh trên màu hồng nhạt của môi trường.
* Đặc tính sinh hoá
Vi khuẩn Salmonella lên men sinh hơi glucose, lên men manitol, dulcitol, sorbitol, rhamnose, arabinose, maitose, xylose và trehalose. Không lên men lactose, saccarose, salicin và adonitol, urease, indol, VP âm tính. Không làm tan chảy gelatin, MR và H2S dương tính, sử dụng citrate, ...
1.4.4.2. Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella
* Đặc tính gây bệnh
Dựa vào tính gây bệnh với động vật người ta chia vi khuẩn Salmonella thuộc các nhóm huyết thanh khác nhau thành 4 nhóm sinh học khác nhau:
- Nhóm 1 gồm các chủng Samonella gây ở một số động vật nhất định bệnh thương hàn hay bại huyết (vi khuẩn xâm nhập và phát triển ở trong máu), trong nhiều trường hợp vi khuẩn có tính kết bám tế bào (nhờ nhung mao - pili), tính xâm nhập (nhờ gen invA - E) và tính sinh sản nội bào, hoặc ở một số khác gây bệnh phó thương hàn nhờ tính đề kháng huyết thanh, tính sinh sản nội tế bào lưới nội bì, tính sinh độc tố gây chết. Nhóm này gồm có Salmonella typhi, Samonella paratyphi A (gây bệnh thương hàn hoặc phó thương hàn ở người), Samonella gallinarum – pullorum (tiêu chảy – bạch lỵ ở gà con, thương hàn ở gà trưởng thành),...
Nhóm 2 gồm các chủng Salmonella ngoài gây bệnh thương hàn ở một số động vật nhất định còn gây bệnh viêm dạ dày – ruột cấp tính hoặc bại huyết ở người
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 và một số động vật khác. Samonella paratyphi B (phó thương hàn ở người), Samonella typhimurium (thương hàn ở chuột), Samonella choleraesuis (tiêu chảy ở lợn), Samonella typhisuis (thương hàn lợn),... Trong cả hai nhóm 1 và 2 đều có vi khuẩn chứa plasmid quyết định tính gây bệnh đặc trưng typ huyết thanh học.
Nhóm 3 gồm các Salmonella không thuộc dạng huyết thanh nêu trên, không có tính đặc hiệu ký chủ, nhưng gây bệnh viêm dạ dày – ruột cấp tính ở người và chó.
Nhóm 4 gồm các Salmonella trừ Samonella choleraesuis subsp.
choleraesuis, trung tâm là Samonella choleraesuis subsp. arizonae, Samonella choleraesuis subsp. salamae gây bệnh ở động vật máu lạnh.
Ngoài ba dạng huyết thanh vi khuẩn Salmonella là Typhi (trực khuẩn thương hàn người), Paratyphi A (trực khuẩn phó thương hàn) và Paratyphi B, các dạng huyết thanh khác có thể là nguyên nhân viêm dạ dày – ruột cấp tính, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, sốt là những triệu chứng chính; thời kỳ tiềm ẩn khoảng 18 – 36 giờ và còn có trường hợp máu nhiễm khuẩn, bại huyết, viêm màng tủy, viêm màng xương,...
Nhiễm trùng do Salmonella gây nên là loại bệnh nhiễm trùng phổ biến thứ hai ở Hoa Kỳ. Theo số liệu thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh ở Hoa Kỳ cho biết, có khoảng 1,4 triệu người bị bệnh, kết quả là 16.000 người phải điều trị tại bệnh viện và 600 người chết (Gregerson, 2004).
Lowry and Bates (1989) sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm đều không an toàn cho sức khỏe con người.
Nguyễn Ngọc Tuân (1997) cho biết, Salmonella là vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhất trong các loại vi khuẩn cần kiểm tra trong thực phẩm, nhất là thịt tươi sống.
Nhìn chung Salmonella trong thực phẩm là loại vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe con người; vì vậy, tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046: 2002 quy định tất cả các loại thực phẩm không được có vi khuẩn này trong 25g mẫu kiểm tra.
* Sức đề kháng
Salmonella khó sinh sản ở trong nước thường nhưng có thể tồn tại một tuần, trong nước đá có thể sống 2 – 3 tháng. Trong xác động vật chết chôn ở bùn, cát có thể sống 2 – 3 tháng. Salmonella có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) được 4 – 8 tháng ở nhiệt độ 6 – 120C.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Với nhiệt độ: Vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1 giờ; 700C trong 20 phút, đun sôi trong 5 phút, khử khuẩn theo phương pháp Pasteur cũng bị diệt.
Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau 5 giờ ở nước trong và 9 giờ ở nước đục.
Các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn: phenon 5%, HgCl 1/500; formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 – 20 phút.
1.4.4.3. Salmonella có hai loại độc tố: nội độc tố và ngoại độc tố.
Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, với liều thích hợp tiêm tĩnh mạch, vi khuẩn giết chết chuột bạch, chuột lang trong vòng 48 giờ với bệnh tích đặc trưng ruột non sung huyết, mảng payer phù nề, đôi khi hoại tử. Độc tố ở ruột gây độc thần kinh, gây hôn mê, co giật, nội độc tố có hai loại: loại gây sung huyết và mụn loét.
Ngoại độc tố chỉ phát hiện được khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc này có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm.
1.4.5. Campylobacter
1.4.5.1. Những đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Campylobacter
* Đặc tính hình thái
Campylobacter là những vi khuẩn Gram âm, có dạng chữ S hoặc dấu phẩy, có một lông roi ở một cực hoặc ở hai cực, di động theo dạng vặn nút chai. Kích thước vi khuẩn 0,2 – 0,8 x 0,5 – 5,0 àm nhưng đụi khi lại cú dạng cầu khuẩn. Thụng thường không có giáp mô, tuy có khi C. jejuni lại thấy giáp mô. Có 16 loài và 6 phân loài, với các trường hợp nhiễm bệnh ở người, phần lớn (99%) các chủng phân lập được là C. jejuni, C. coli và C. lari, trong đó chủ yếu là C. jejuni .
* Đặc tính nuôi cấy
C. fetus khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 370C dưới điều kiện 5 – 10% CO2 sau 2 – 5 ngày thì hình thành khuẩn lạc không dung huyết, màu tro trắng hơi đục. C. mucosalis, C. hyointestinalis đều phát triển ở 250C và 420C nhưng C.
fetus ở 420C và C. jejuni ở 250C thì đều không phát triển.
Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường thạch mCCD (thạch deoxycholat
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 xefoperazon than cải biến), sau khi ủ trong 44 giờ ở 41,50C hình thành khuẩn lạc có màu xám, thường có lấp lánh ánh kim loại, phẳng và ướt có xu hướng mọc lan tỏa.
* Đặc tính sinh hoá
Các loài Campylobacter tham gia vào các phản ứng thủy phân catalaza, hipurat, indoxyl axetat. Phản ứng oxidaza dương tính, không phân hủy hydratcacbon.
1.4.5.2. Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng của vi khuẩn Campylobacter
* Đặc tính gây bệnh
Campylobacter spp. có mặt trong đường ruột của rất nhiều loài động vật hoang dại và động vật nuôi: C. jejuni thấy trong thịt gà, C. coli thấy trong thịt lợn.
Ăn thịt gia cầm (chủ yếu là thịt gà) không được nấu chín, sự ô nhiễm chéo từ thịt gà sống sang thực phẩm, uống nước từ nguồn nước không khử trùng, bị ô nhiễm là những nguyên nhân gây ra các ca ngộ độc (Griffiths and Park, 1990).
Ở Mỹ, Campylobacter được đánh giá là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh đường ruột, có thể gây những triệu chứng tiêu chảy từ trung bình đến dữ dội, phân lỏng lẫn nước, đôi khi kèm theo lẫn máu. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2000) bệnh do Campylobacter được đánh giá là bệnh truyền lây giữa người và động vật.
* Sức đề kháng
Các vi khuẩn Campylobacter thông thường tồn tại trong đường ruột, xoang miệng và cơ quan sinh dục, vi khuẩn đề kháng yếu với sự khô, nóng, hóa chất tiêu độc, trên các môi trường nuôi cấy cũng dễ dàng bị hủy diệt.
1.4.5.3. Độc tố
C. jejuni sản sinh độc tố (gây) độc tế bào chịu nhiệt, enterotoxin không chịu nhiệt, độc tố dung huyết, là nguyên nhân bệnh cảm nhiễm đường ruột và trúng độc thực phẩm.
Nhờ có tiêm mao như là yếu tố gây bệnh, C. jejuni hấp phụ, kết bám lên bề mặt niêm mạc ruột, sản sinh enterotoxin không chịu nhiệt mà gây quá trình mất nước tế bào, nhờ tính xâm nhập của chất protein màng ngoài vi khuẩn, tác dụng của độc tố dung huyết chịu nhiệt và độc tố tế bào chịu nhiệt mà gây hoại tử tế bào thượng bì đường ruột.