Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Để đánh giá thực trạng thú y tại quầy kinh doanh thịt gia súc, gia cầm chúng tôi tiến hành điều tra 284 phiếu tại các hộ kinh doanh.
Mẫu phiếu điều tra được thiết kế dựa trên TCVN 5452 – 91 ban hành ngày 17 tháng 7 năm 1991.
Lập phiếu điều tra đến từng hộ kinh doanh thịt gia súc, gia cầm đang bày bán ở một số chợ trên địa bàn tỉnh.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên mẫu thịt lợn và gà bày bán ở quầy kinh doanh, tại mỗi hộ kinh doanh.
Kỹ thuật lấy mẫu thịt lợn: Dùng miếng gạc hoặc mút vô trùng (kích thước 10cm x 10cm) lau thân thịt. Sử dụng khuôn vô trùng, dùng ngón tay cái và ngón trỏ ấn mạnh miếng gạc và xoay tròn. Diện tích mẫu được lau theo chiều ngang, chiều dọc và đường chéo khoảng 10 lần theo mỗi hướng. Đặt miếng gạc trong hộp hoặc túi vô trùng với 40ml dung dịch pha loãng cuối cùng. Mẫu thu được cho vào thùng chứa mẫu được lưu giữ ở 20C ± 20C và sau đó chuyển đến phòng thí nghiệm. Thời gian từ lúc lấy mẫu và xét nghiệm không được vượt quá 24 giờ.
Kỹ thuật lấy mẫu thịt gà: Cho nửa thân thịt gà vào túi bằng chất dẻo vô trùng.
Mẫu thu được cho vào thùng chứa mẫu được lưu giữ ở 20C ± 20C và sau đó chuyển đến phòng thí nghiệm. Thời gian từ lúc lấy mẫu và xét nghiệm không được vượt quá 24 giờ.
Kỹ thuật lấy mẫu nước: Xả trước 2 – 3 phút. Các bình chứa mẫu phải được khử trùng ở 1200C . Sau khi xả nước (2 – 3 phút), cần khử trùng vòi nước (dùng lửa đối với vòi bằng kim loại và dung dịch sát trùng với vòi bằng chất dẻo). Lấy mẫu xong, cần đậy kín bình chứa mẫu. Sau khi lấy, mẫu bảo quản ở 5 – 200C, thời gian chuyển đến phòng thí nghiệm tối đa 08 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Kỹ thuật lấy mẫu lau bề mặt dụng cụ: Làm ẩm miếng gạc trước khi lấy mẫu.
Gạc sau khi làm ẩm được cọ xát trên một diện tích bề mặt 100cm2, sử dụng khuôn vô trùng, dùng ngón tay cái và ngón trỏ ấn mạnh miếng gạc và xoay tròn. Diện tích mẫu được lau theo chiều ngang, chiều dọc và đường chéo khoảng 10 lần theo mỗi hướng. Đặt miếng gạc trong hộp hoặc túi vô trùng với 40 ml dung dịch pha loãng cuối cùng. Mẫu thu được cho vào thùng chứa mẫu được lưu giữ ở 20C ± 20C và sau đó chuyển đến phòng thí nghiệm. Thời gian từ lúc lấy mẫu và xét nghiệm không được vượt quá 24 giờ.
2.4.3. Phương pháp xét nghiệm
TT Chỉ tiêu phân tích Phương pháp phân tích 1 Salmonella TCVN 4829: 2005 (ISO 6579: 2002)
2 Campylobacter TCVN 7715 – 1: 2007 (ISO 10272 – 1: 2006) 3 E. coli TCVN 7924 – 2: 2008 (ISO 16649 – 2: 2001)
4 TS VKHK TCVN 4884: 2005
5 Coliform TCVN 6187 – 2: 1996 (ISO 9308 – 2: 1990) 6 Enterobacteriaceae TCVN 5518 – 2: 2007 (ISO 21528 – 2: 2004) 2.4.3.1. Salmonella
+ Nguyên tắc:
a. Quy trình phát hiện Salmonella cần qua bốn giai đoạn kế tiếp nhau b. Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc: cấy phần mẫu thử trong dung dịch đệm peptone ở nhiệt độ phòng sau đó ủ ở 370C ±10C trong 18
±2 giờ. Đối với số lượng lớn thì làm nóng dung dịch đệm pepton đến 370C ±10C trước khi cấy mẫu thử.
c. Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: Cấy dịch tăng sinh chọn lọc thu được trong mục b vào môi trường Rappaport-Vassiliadis với đậu tương (môi trường RVS) và môi trường Tetrathionat/novobioxin muller-kauffmann (môi trường MKTTn). Môi trường RVS được ủ ở 24 ± 3 giờ/41,50C ± 10C và môi trường MKTTn được ủ ở 24 ± 3 giờ/ 370C ± 10C.
d. Đổ đĩa và nhận dạng
Cấy dịch tăng sinh thu được trong mục c vào hai môi trường đặc chọn lọc.
Thạch deoxycholat lyzin xyloza (thạch XLD).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 Thạch XLD được ủ ở 370C ± 10C và được kiểm tra sau 24 ± 3 giờ.
e. Khẳng định để nhận dạng
Các khuẩn lạc Salmonella giả định được cấy truyền rồi đổ đĩa như mục d và khẳng định để nhận dạng chúng bằng phép thử sinh hóa.
Khẳng định sinh hóa:
Thạch ure: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch ủ ở 370C ± 10C trong 24 ± 3 giờ và kiểm tra thường xuyên. Nếu phản ứng dương tính thì sự phân giải ure thành amoniac làm phenol màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng, phản ứng thường xuất hiện sau 2 – 4 giờ.
Môi trường L - lyzin đã khử nhóm cacboxyl: cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng ủ ở 370C ± 10C trong 24 ± 3 giờ, màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính, màu vàng là phản ứng âm tính.
Môi trường phản ứng indol: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường trypton/tryptophan ủ ở 370C± 10C trong 24 ± 3 giờ, sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs, nếu có xuất hiện một vòng màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính.
+ Sơ đồ phân lập, giám định:
Cân 25 gam thịt lợn cho vào túi đựng mẫu.
Cho 225 ml dung dịch đệm pepton vào ở nhiệt độ phòng.
Đem ủ ở 18 ± 2 giờ/ 370C ± 10C.
Lấy 0,1ml chủng cấy cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml RVS (Rappaport- Vassiliadis), đem ủ 24 ± 3 giờ/41,50C ± 10C.
Cấy chuyển vào môi trường thạch XLD, ủ trong 24 ± 3 giờ/370C ± 10C.
Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu âm tính thử 4 khuẩn lạc khác được đánh dấu.
Cấy vào thạch dinh dưỡng ủ trong 24 ± 3 giờ/370C ± 10C.
Kiểm tra phản ứng sinh hóa.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 2.4.3.2. Campylobacter
+ Nguyên tắc:
a. Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: Mẫu thử được cấy vào môi trường tăng sinh lỏng (canh thang Bolton) và trộn đều đem ủ ở 370C trong 4 – 6 giờ ở môi trường vi hiếu khí rồi ủ tiếp ở 41,50C trong 44 ±4 giờ.
b. Phân lập và chọn lọc để khẳng định: Cấy dịch cấy thu được trong mục a vào môi trường đặc chọn lọc, thạch deoxycholat xefoperazon than cải biến (thạch mCCD), sau đó ủ ở 41,50C trong môi trường vi hiếu khí và kiểm tra sau 44 ±4 giờ để phát hiện sự có mặt các khuẩn lạc Campylobacter giả định theo các đặc trưng của chúng.
c. Khẳng định: Các khuẩn lạc Campylobacter giả định được cấy truyền lên môi trường huyết Columbia không chọn lọc và khẳng định bằng các phép kiểm tra kính hiển vi, phép thử sinh hóa và phát triển thích hợp. Tùy chọn các loài Campylobacter được nhận dạng bằng các phép thử sinh hóa đặc trưng và các phép thử độ nhạy kháng sinh.
Kiểm tra hình thái và tính di động: Hòa một khuẩn lạc từ đĩa thạch huyết Columbia vào 1ml canh thang Brucella và kiểm tra về hình thái và tính di động bằng kính hiển vi, trực khuẩn uốn cong có di động xoáy mở nút chai.
Phát hiện oxidaza: Dùng vòng cấy lấy một phần của mỗi khuẩn lạc tách biệt từ mỗi đĩa ria cấy lên giấy lọc đã được làm ẩm bằng thuốc thử oxidaza viền ngoài có màu tím hoa cà màu tím hoặc màu xanh đậm trong 10 giây chứng tỏ phản ứng dương tính.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 + Sơ đồ phân lập, giám định:
Cân 25 gam da gà cho vào túi đựng mẫu.
Cho 225 ml canh thang Bolton vào đem ủ trong điều kiện vi hiếu khí ở 370C trong 4 – 6 giờ và sau đó ở 41,50C/ 44 ± 4 giờ.
Cấy vào môi trường thạch mCCD, ủ trong điều kiện vi hiếu khí ở 41,50C/ 44 ± 4giờ.
Cấy các khuẩn lạc điển hình lên 3 đĩa thạch Columbia agar, ủ các đĩa trong môi trường vi hiếu khí ở 41,50C trong 24 đến 48 giờ.
Hòa 1 khuẩn lạc vào 1ml canh thang Brucella.
Kiểm tra hình thái, tính di động.
2.4.3.3. E. coli
+ Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu thử xác định hoặc một lượng xác định huyền phù ban đầu lên các đĩa kép chứa môi trường trypton - mật - glucuronic (TBX).
Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu cấy vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng, trong cùng một điều kiện.
Các đĩa này được ủ ở 440C trong 18 giờ đến 24 giờ rồi kiểm tra để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng mà được gọi là Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.
Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc của Escherichia coli dương tính β- glucuronidaza trên gam hoặc trên ml mẫu được tính.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 + Sơ đồ phân lập, giám định:
Cân 25 gam thịt lợn cho vào túi đựng mẫu.
Cho 225 ml dung dịch đệm pepton Water vào ở nhiệt độ phòng.
Lấy 1ml từ túi pha loãng thành 10-2 đến 10-3.
Chuyển 1ml từ mỗi nồng độ pha loãng vào đĩa lồng (2 đĩa/nồng độ).
Đổ thạch TBX (15-20 ml) vào mỗi đĩa (TBX để ở 440C đến 470C).
Đợi thạch đông lại, lật ngược các đĩa.
Đem vào tủ ấm nuôi cấy ở 440C trong vòng 18 – 24 giờ.
Đọc kết quả.
+ Đếm các đơn vị khuẩn lạc hình thành
Sau giai đoạn ủ ấm quy định đếm các đơn vị khuẩn lạc điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU (đơn vị khuẩn lạc) và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình).
+ Biểu thị kết quả:
Đối với kết quả cần đánh giá hiệu lực nhìn chung cần phải đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa ít nhất 15 CFU điển hình.
Tính N số lượng CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên ml hoặc gam sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp.
N=
+
×
×
∑
2 1 0,1n n d V
a
Trong đó:
∑a: là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha loãng liên tiếp có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU xanh.
n1: là số đĩa giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất.
n2: là số đĩa giữ lại tại độ pha loãng thứ hai.
V: thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa tính bằng ml.
d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 2.4.3.4. Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Nguyên lý: Trên môi trường thạch PCA, ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ 370C, sau 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một điểm xuất phát của một tế bào vi khuẩn và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU: Colony Forming Unit) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.
Nuôi cấy: Mỗi mẫu xét nghiệm phải nuôi cấy ở 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa petri đường kính 9cm đã được sấy tiệt trùng, mỗi đĩa 1 ml. Rót 15 ml môi trường PCA ở 450C ± 0,50C vào mỗi đĩa. Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch động đặc. Lật ngược các đĩa và đưa vào nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 72 ± 3 giờ.
Tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau:
d n n N C
) 1 , 0 ( 1+ 2
= ∑
Trong đó:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu.
∑C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1.
n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2.
d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
2.4.3.5. Coliform + Nguyên tắc
Cấy các phần mẫu thử, đã được pha loãng hoặc không pha loãng vào một dãy ống nghiệm chứa một môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza.
Kiểm tra các ống thử sau 24 giờ và 48 giờ nuôi ở nhiệt độ hoặc 350C hoặc 370C; cấy chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện đục kèm theo sinh khí vào một môi trường khẳng định chọn lọc hơn và khi muốn tìm E. coli giả định cấy vào một môi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol.
Nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48 giờ ở nhiệt độ hoặc 350C hoặc 370C để phát hiện các vi khuẩn coliform, và ở 440C trong khoảng 24 giờ để phát hiện các loại coliform chịu nhiệt và E. coli giả định.
Bằng các bảng thống kê, tính toán số xác xuất cao nhất của các dạng coliform, coliform chịu nhiệt và E. coli giả định có thể có mặt trong 100 ml mẫu thử, từ số các ống thử kết quả xác nhận dương tính.
+ Cách tiến hành
- Chuẩn bị mẫu thử và các môi trường cấy
Để chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu và cấy vào môi trường phân lập các phần mẫu thử. Đối với các phần mẫu thử có thể tích lớn hơn 5 ml, sử dụng các ống môi trường phân lập nồng độ kép.
- Nuôi các mẫu thử
Nuôi các ống môi trường đã cấy mẫu trong 48 giờ ở nhiệt độ 350C ± 0,50C, hoặc 370C ± 0,50C.
- Kiểm tra các mẫu thử
Kiểm tra các mẫu thử sau 18 – 24 giờ nuôi ấm và coi là có phản ứng dương tính đối với các ống có biểu hiện đục do vi khuẩn sinh trưởng và sinh khí bên trong các ống lộn ngược (ống Durham), cùng với việc tạo thành axit nếu trong môi trường phân lập có chứa một chỉ thị pH.
Nuôi tiếp trong tủ ấm những ống nghiệm chưa có bất kỳ dấu hiệu nào hoặc mọi biến đổi nói trên và kiểm tra lại chúng sau 48 giờ để tìm phản ứng dương tính.
- Các phép thử khẳng định điều quan trọng cần lưu ý là các phản ứng dương tính trong các ống môi trường phân lập thì chỉ là kết quả giả định về coliform. Do đó cần phải tiến hành các phép thử xác nhận, tốt hơn là trên các chủng cấy thuần khiết.
Cấy truyền, nuôi ấm và kiểm tra: Cấy truyền từ mỗi ống môi trường phân lập
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 có kết quả dương tính vào một hoặc một số ống môi trường khẳng định (Các môi trường kiểm tra tính sinh khí; Các thang lục sáng-lactoza (mật); Môi trường EC) tìm tính sinh khí và sinh indol.
Vi khuẩn coliform: Để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn coliforrm chịu nhiệt, nuôi một ống môi trường EC khác ở nhiệt độ 440C trong 24 giờ và kiểm tra tính sinh khí. Để khẳng định sự có mặt của E. coli giả định cấy vào ống trypton để tạo indol ở 440C trong vòng 24 giờ. Sau đó thêm 0,2 – 0,3 ml thuốc thử kovac vào ống nước trypton (đã cấy mẫu), việc xuất hiện một màu đỏ sau khi lắc nhẹ chứng tỏ sự có mặt của indol.
+ Biểu thị kết quả: Từ số ống môi trường phân lập, tính toán bằng cách tham khảo các bảng tra thống kê trong ISO 8199, số xác xuất cao nhất của vi khuẩn coliform chịu nhiệt và E. coli giả định có trong 100 ml mẫu thử.
2.4.3.6. Enterobacteriaceae
+ Nguyên tắc
- Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.
- Phân lập:
Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác, vào hai đĩa petri (dùng kỹ thuật đổ đĩa) chứa thạch glucoza mật đỏ tím. Phủ lên trên bằng một lớp môi trường thạch này.
Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Ủ các đĩa thạch này ở 370C (hoặc 300C) trong 24 ± 2 giờ.
- Khẳng định
Các khuẩn lạc Enterobacteriaceae giả định được cấy truyền lên môi trường không chọn lọc và khẳng định bằng các phép thử lên men glucoza và kiểm tra sự có mặt của oxidaza.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 - Tính toán
Tính số lượng Enterobacteriaceae có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc điển hình đã khẳng định trên mỗi đĩa.
+ Cách tiến hành
- Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo:
Chuẩn bị một dãy các dung dịch pha loãng từ mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc từ huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.
- Cấy và ủ:
Lấy hai đĩa petri vô trùng có đường kính từ 90 đến 100 mm. Dùng một pipet vô trùng chuyển vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.
Lấy hai đĩa petri vô trùng khác. Sử dụng một pipet vô trùng mới chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất huyền phù ban đầu (10-2) nếu sản phẩm ở dạng khác.
Lặp lại quy trình này với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 10 ml môi trường glucoza mật đỏ tím đã được chuẩn bị rồi làm nguội đến nhiệt độ từ 440C đến 470C trên nồi cách thủy. Thời gian tính từ khi rót môi trường vào đĩa petri và cấy không được quá 15 phút.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng chuyển động ngang và để môi trường đông đặc, để các đĩa petri trên mặt phẳng, mát.
Sau khi hỗn hợp đông đặc, phủ lên trên một lớp dày khoảng 15 ml môi trường glucoza mật đỏ tím, đã được chuẩn bị và làm nguội theo trên, để ngăn ngừa vi khuẩn mọc lan rộng và để đảm bảo điều kiện nửa kỵ khí. Để đông đặc lại như mô tả ở trên.