2.6.1.1. Kích thước mẫu thức ăn
Menke và Steingass (1988) đã chỉ ra rằng kích thước của mẫu có ảnh hưởng đến tốc độ sinh khí trong thời gian ủ. Các mẫu được nghiền nhỏ có khả năng lên men nhanh hơn các mẫu không được nghiền. Đối với các thức ăn dễ hoà tan, thức ăn tinh thì ảnh hưởng này là không đáng kể, nhưng đối với thức ăn khó hoà tan, thức ăn có hàm lượng xơ cao, phân giải chậm thì tốc độ sinh khí tăng lên khi mẫu được nghiền nhỏ. Các ông cũng chỉ ra rằng độ nghiền nhỏ của của hạt thức ăn thí nghiệm tốt nhất là không lớn hơn 1mm. Điều này được Menke và Steingass (1988) giải thích rằng việc nghiền nhỏ mẫu làm tăng diện tích tiếp xúc bề mặt các mảnh thức ăn và vi sinh vật trong môi trường ủ.
2.6.1.2. Khối lượng mẫu thức ăn
Theo Theodorou và cộng sự (1994) thì khi tăng khối lượng mẫu (chất nền) sẽ làm thể tích khí tăng lên, nhưng tốc độ sinh khí không bị ảnh hưởng.
Tuy nhiên, khối lượng mẫu đem ủ chỉ khoảng từ 200 - 300mg tuỳ từng loại thức ăn. Đối với các loại thức ăn dễ lên men, tiêu hoá khối lượng mẫu nên là 200mg, với các thức ăn lên men chậm thì khối lượng mẫu nên là 300mg để đảm bảo rằng lượng khí sinh ra khi ủ mẫu không lớn hơn 100ml (Menke và Steingass, 1988).
2.6.1.3. Chuẩn bị mẫu thức ăn
Trong quá trình chuẩn bị mẫu yếu tố lớn nhất ảnh hưởng đến kết quả
trong thí nghiệm sinh khí in vitro là việc sấy mẫu. Theo Tilley và Terry (1963), khi sấy mẫu ở nhiệt độ cao trong thời gian quá dài có thể làm biến tính một số cấu trúc hoá học trong thành phần hoá học của thức ăn. Nên làm lạnh - khô mẫu và sấy mẫu bằng lò sấy không làm thay đổi lượng khí sinh ra trong quá trình ủ. Mặt khác, tốc độ lên men của mẫu ủ trong điều kiện in vitro nếu sử dụng các mẫu đã được sấy khô và nghiền nhỏ độ chính xác sẽ cao hơn so với các mẫu chưa qua xử lý (Menke và Steingass, 1988).
2.6.2. Ảnh hưởng của dịch ủ
Dịch ủ trong thí nghiệm sinh khí in vitro bao gồm dung dịch đệm và dịch dạ cỏ (lấy từ bò mổ lỗ dò) được trộn lại với nhau theo một tỷ lệ nhất định. Như vậy, cả hai nguồn dịch này đều làm ảnh hưởng đến kết quả sinh khí trong thí nghiệm sinh khí sinh khí in vitro.
2.6.2.1. Ảnh hưởng của dịch dạ cỏ
Rymer và cộng sự (1999) cho rằng tốc độ sinh khí trong thí nghiệm sinh khí in vitro có mối quan hệ với nồng độ dịch dạ cỏ trong dung dịch ủ. Dịch ủ càng đậm (tức là nồng độ dịch dạ cỏ cao) thì tốc độ sinh khí càng nhanh.
Thời gian lấy dịch dạ cỏ cũng ảnh hưởng đến kết quả sinh khí. Nên lấy dịch dạ cỏ trước khi cho gia súc ăn sáng và lấy cách nhau ba ngày để hạn chế ảnh hưởng của hoạt lực của vi sinh vật đến kết quả thí nghiệm của thức ăn trong quá trình ủ (Menke và Steingass, 1988). Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của dịch ủ đến khả năng sinh khí, Menke và Steingass (1988) còn cho rằng nguồn dịch dạ cỏ lấy từ các loài gia súc khác nhau là khác nhau. Do đó, trong các thí nghiệm sinh khí in vitro cần chú ý đến nguồn lấy dịch dạ cỏ để có thể hiệu chỉnh cho phù hợp.
Khẩu phần ăn cho gia súc cũng có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả sinh khí thông qua việc ảnh hưởng đến thành phần dịch dạ cỏ và khu hệ vi sinh vật dạ cỏ. Negadi và cộng sự (2002) cho rằng sử dụng khẩu phần 400-600g thức ăn tinh/kgVCK khẩu phần đảm bảo cho VSV dạ cỏ phát triển tốt cũng như
việc lấy dịch dạ cỏ từ các gia súc ăn khẩu phần này sẽ gặp ít ảnh hưởng do hoạt lực của vi sinh vật đến khả năng sinh khí trong thí nghiệm sinh khí in vitro.
2.6.2.2. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm
Dung dịch đệm trong các thí nghiệm sinh khí in vitro thường gồm các dung dịch sau: dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng và dung dịch khử Resazurin. Các dung dịch trên được hoà trộn theo tỷ lệ nhất định để tạo thành dung dịch đệm 2 sau đó pha với dịch dạ cỏ để tạo thành dịch ủ. Do đó, thành phần các dung dịch đệm có ảnh hưởng đến kết quả sinh khí in vitro.
Carbohydrate trong tầng đệm có ảnh hưởng đến kết quả sinh khí in vitro. Trong dung dịch ủ nó gián tiếp tạo ra một lượng khí qua phản ứng giữa các ion bicarbonate và các axit lên men. Carbohydrate là thành phần quan trọng của hệ thống chất đệm trong thí nghiệm sinh khí in vitro góp phần tạo ra môi trường gần giống với môi trường dạ cỏ in vivo. Nếu carbohydrate đặc trưng cho phương pháp sinh khí thì khi kết hợp với Nitơ (N) để đánh giá kết quả sinh khí trong thí nghiệm sinh khí in vitro càng cho kết quả chính xác hơn. Tuy nhiên, trong dung dịch đệm nếu carbohydrate dư thừa lại kết hợp với N dư thừa trong môi trường thì sau đó vi sinh vật sẽ thừa năng lượng (Russell và Strobel, 1991). Do đó trong quá trình chuẩn bị dung dịch đệm cần chú ý tính toán để N không bị dư thừa trong dung dịch đệm.
Như vậy, nhu cầu về N trong chất đệm phụ thuộc vào lượng carbohydrate bổ sung. Khi carbohydrate được bổ sung nhiều hơn thì quá trình lên men diễn ra nhanh hơn và cần nhiều N hơn để phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật. Khi tiến hành pha dung dịch đệm cần chú ý đến việc bổ sung hàm lượng N cho thích hợp vào trong chất nền để đảm bảo lượng cacbohydrate từ chất nền không bị dư thừa. Nếu không đủ hàm lượng N trong dung dịch đệm có thể làm ảnh hưởng tới kết quả lên men sinh khí.
2.6.3. Một số yếu tố ảnh hưởng khác
Ngoài những ảnh hưởng ở trên trong thí nghiệm sinh khí in vitro còn có một số các ảnh hưởng khác như: ảnh hưởng của việc sử dụng mẫu trắng (mẫu Blank), ảnh hưởng của trang thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm, ảnh hưởng của các phòng thí nghiệm khác nhau. Nếu không có những biện pháp hiệu chỉnh cho phù hợp thì những yếu tố ảnh hưởng này có thể làm sai lệch kết quả khi tính toán trong thí nghiệm sinh khí in vitro.