Xác định ảnh hưởng của BLBĐ tới sản sinh khí methane được xác định tại thời điểm 48 giờ sau khi ủ bằng phương pháp đo bằng máy GC và phương pháp sử dụng dung dịch NaOH (10M) chất được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng BLBĐ tới lượng khí methane sản sinh tại thời điểm 48 giờ
a-f: Các chữ cái trong cùng một hàng khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Nghiệm thức
ĐC (0%) 1% 2% 3% 4% 5% 6%
Phương pháp
N = 3
SEM CH4 (%) 40,75a 39,45a 36,76ab 36,94ab 34,25abc 30,95bc 29,25c 1,86 NaOH
CH4 (ml) 21,38a 20,38ab 17,76bc 17,76bc 16,10cd 13,88de 12,55e 0,88 CH4 (%) 37,32a 35,62ab 33,83b 33,65b 30,41c 27,76d 26,65d 0,57 GC CH4 (ml) 19,58a 18,40b 16,34c 16,18c 14,29d 12,45e 12,45f 0,40
SEM (Standard Error of the Means): sai số tiêu chuẩn của các số trung bình
Kết quả cho thấy sự khác nhau đáng kể giữa các mức bổ sung (P<0,05), lượng khí methane đo bằng cả hai phương pháp ở các mức bổ sung từ 1 đến 6% BLBĐ đều cho lượng khí CH4 thấp hơn so với nhóm đối chứng và lượng khí sinh ra giảm dần khi tăng mức bổ sung BLBĐ. Nhận thấy lượng khí CH4 (tính theo ml) sinh ra giảm rõ rệt bắt đầu từ mức bổ sung 2 và 3% BLBĐ so với mức đối chứng ở cả hai phương pháp xác định, sau đó lượng khí CH4 sinh ra tiếp tục giảm mạnh và thấp nhất ở mức bổ sung 6% BLBĐ. Cụ thể, ở phương pháp xác định CH4 bằng hóa chất NaOH thì lượng khí CH4 sinh ra cao nhất ở mức đối chứng là 21,32ml (không bổ sung BLBĐ) và thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 6% BLBĐ là 12,55 ml. Tương tự ở phương pháp xác định CH4 bằng máy GC, CH4 sinh ra cao nhất ở mức đối chứng (không bổ sung BLBĐ) là 19,58ml và thấp nhất ở mức bổ sung 6% BLBĐ là 12,45ml.
Như vậy qua bảng 4.3, bảng 4.4 và bảng 4.5 nhận thấy lượng khí CH4 sản sinh ở nghiệm thức bổ sung 2% BLBĐ thấp hơn đáng kể (P<0,05) so với nghiệm thức đối chứng (không bổ sung BLBĐ) tuy nhiên tỷ lệ tiêu hóa lại không giảm tại thời điểm 48 giờ ủ ấm. Từ các nghiệm thức bổ sung 3 tới 6%
mới thấy sự sai khác rõ rệt so với mức đối chứng về tỷ lệ tiêu hóa thực in
vitro tại thời điểm 48 giờ ủ ấm.
Mặc dù hàm lượng tannin không có khả năng phân hóa (Condensed tannin - CT) trong lá Bạch đàn không cao nhưng nó vẫn có tác dụng làm giảm lượng CH4 sản sinh. Salem và cộng sự (2006) đã công bố rằng thành phần hóa học của Bạch Đàn có chứa CT và các loại dầu thiết yếu với hàm lượng 6,81%
(tính theo VCK) và 15,5ml/kgVCK tương ứng. Thành phần p-xymen trong tinh dầu làm giảm 29% khí CH4 ở nồng độ 20 mg/l (Chaves và cộng sự, 2008). Sallam và cộng sự (2009) phát hiện ra rằng các loại dầu Bạch Đàn ức chế sản sinh CH4 từ 29,6 - 90,3% thông qua việc làm giảm số lượng protozoa so với điều kiện bình thường. Theo kết quả nghiên cứu của Field và cộng sự (1989) chỉ ra tác dụng của CT lên sự ức chế methane có thể thông qua tác động trực tiếp lên vi khuẩn sinh khí methane, điều này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của tannin không có khả năng phân hóa và chủng vi khuẩn.
Nghiên cứu trên môi trường dạ cỏ hỗn hợp, Bhatta và cộng sự (2009) nghiên cứu trên mẫu Quebracho tannin (Công ty TNHH Kawamura, Asakusabashi, Tokyo) chỉ ra rằng với công thức 3,94% tannin có khả năng thủy phân (hydrolysable tannin - HT) và 1,33% tannin không có khả năng phân hóa (Condensed tannin – CT) ở tỉ lệ 50g/kg chất nền hỗn hợp không làm giảm số lượng vi khuẩn sinh khí methane. Tannin ức chế hoạt động của vi sinh vật trong dạ cỏ (Patra và Saxena, 2009), từ đó có thể gây ảnh hưởng xấu đến sự lên men trong dạ cỏ và sự tiêu hóa thức ăn. Một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất của tannin hoặc các thực vật có chứa tannin làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn trong cả môi trường in vitro (Patra và cộng sự, 2006; Bhatta và cộng sự, 2009) và in vivo (Animut và cộng sự, 2008; Grainger và cộng sự, 2009). Thường các kết quả cho rằng tỷ lệ tannin cao hơn 5% trong khẩu phần có ảnh hưởng xấu đến khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng và sức sản xuất của động vật, nhưng ảnh hưởng này còn phụ thuộc vào loại tannin (Waghorn, 2008). Sự giảm khả năng phân giải protein
trong dạ cỏ gây ra bởi phức hợp tannin- protein ngăn cản protein được phân giải bởi vi sinh vật dạ cỏ, điều này cần thiết để con vật chủ sử dụng được protein đó (Mueller - Harver, 2006). Tuy nhiên, tannin phát huy hoạt động ức chế vi sinh vật bao gồm vi khuẩn phân giả xơ và nấm thông qua việc ức chế sự phát triển của chúng (Patra và Saxena, 2009), có thể đã ảnh hưởng đến khả năng sử dụng chất xơ. Sử dụng mức tannin cao trong khẩu phần (cao đến mức sau khi hấp thụ hết protein vẫn còn tannin) có thể làm giảm khả năng tiêu hóa xơ thông qua việc tạo phức với lignocellulose do đó ngăn cản sự phân giải thức ăn của vi sinh vật hoặc bằng cách trực tiếp ức chế hệ vi sinh vật phân giải xơ và hoạt động của men phân giải xơ hoặc cả hai. Có bằng chứng rằng sự giảm khí methane sản sinh mà không làm giảm tổng lượng ABBH sinh ra và khả năng tiêu hóa là có thể (Carulla và cộng sự, 2005; Bhatta và cộng sự, 2009), điều này có thể đưa ra ứng dụng vào thực tế. Một ảnh hưởng có lợi khác của tannin được báo cáo đó là do sự bảo vệ protein khỏi sự phân giải trong dạ cỏ nên đã làm tăng nguồn protein trao đổi đưa đến tá tràng, ngăn chặn hiện tượng chướng hơi dạ cỏ và làm tăng nồng độ axit linoleic liên hợp trong sản phẩm của động vật nhai lại (Waghorn, 2008; Mueller - Harver, 2006). Nhìn chung, tannin có thể làm giảm lượng khí methane sinh ra thông qua việc làm giảm số lượng protozoa và giảm sự phân giải xơ. Điều này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của tannin và loại vi sinh vật sinh khí methane. Bổ sung tannin ở nồng độ cao có thể ảnh hưởng đến thu nhận thức ăn và sự lên men ở dạ cỏ.
Kumar và cộng sự (2009) cho rằng việc bổ sung của các loại tinh dầu Bạch đàn làm giảm CH4 sản sinh từ 13 - 58%, giảm tổng số axit béo bay hơi và số lượng protozoa. Ngoài ra tinh dầu Bạch đàn với các hoạt tính sinh học như ức chế vi khuẩn, nấm, chống viêm và làm thay đổi đặc điểm dạ cỏ, chống protozoa và giảm thiểu methane có thể là do việc giảm lên men thức ăn (Sallam và cộng sự, 2009). McSweeney và cộng sự (2001) cho rằng tỷ lệ tiêu
hóa chất khô và chất hữu cơ của lá Bạch đàn thấp là do giảm số lượng vi khuẩn phân giả xơ hoặc suy giảm độ bám dính của vi khuẩn với thức ăn và giảm hoạt động phân giải xơ của vi khuẩn fibrolytic (Bento và cộng sự, 2005).
Tuy nhiên lượng vi khuẩn phân giả xơ giảm hay tổng số vi sinh vật dạ cỏ giảm sẽ dẫn đến hoạt động tiêu hóa các chất dinh dưỡng cũng giảm và kết quả là giảm quá trình tạo H2 từ acetate do vi khuẩn fibrolytic có thể đã góp phần vào giảm sản sinh CH4 (Carulla và cộng sự, 2005). Hơn nữa Burt (2004) chỉ ra rằng các phân tử của tinh dầu rất nhỏ bé có thể đã xâm nhập vào màng trong của vi khuẩn gram âm và phá hủy nó, tinh dầu cũng có thể gây đông đặc tế bào chất của vi khuẩn.
Ngoài ra, Delaquis và cộng sự (2002) kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu thô và dầu chiết tách của Bạch đàn (giống Camaldulensis – Bạch đàn đỏ) thấy rằng chúng có khả năng chống lại một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Các đặc tính chống lại một loạt các vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, protozoa và nấm của chúng cũng được chứng minh (Chao và cộng sự, 2000). Các loại tinh dầu khác nhau thì mức độ chống lại vi khuẩn gram dương và vi khuẩn Gram âm là khác nhau (Dorman và Deans, 2000). Do đó sự thay đổi thành phần giữa các loại tinh dầu đủ để gây ra biến đổi trong mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Burt, 2004). Lá Bạch đàn chứa tannin flavonoid và các loại dầu dễ bay hơi.
Ức chế tương tác giữa các hydrocacbon không no cũng như các hợp chất thực vật phụ khác có thể ức chế hoạt động của protozoa trong dạ cỏ và các vi khuẩn lên men sinh khí methane (sallam và cộng sự, 2009).
Theo Evans và Martin (2000) khi bổ sung thymol, thành phần chính của dẫn xuất tinh dầu thymus từ cây Bách lý hương và Kinh giới với lượng 0,4g/l dịch dạ cỏ có ảnh hưởng lớn đến lượng CH4 sản sinh trong điều kiện in vitro, tuy nhiên nồng độ acetate và propionate cũng giảm theo. Một nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, tinh dầu từ cây Kinh giới và thành phần chính của
nó, thymol có thể giảm lượng CH4 sinh ra tới 99% khi bổ sung với nồng độ 6mM (Macheboeuf và cộng sự, 2008).
Có nhiều nghiên cứu in vitro chỉ ra khả năng ức chế sản sinh CH4 trong dạ cỏ của tinh dầu hỗn hợp và chiết xuất dẫn xuất từ cây nhiều loại cây hương liệu và cây trồng. Tinh dầu từ quả cây Bách xù (tròn), tinh dầu Quế (Chaves và cộng sự, 2008), và tinh dầu Bạc hà (Tatsouka và cộng sự, 2008; Agarwal và cộng sự, 2009) có khả năng ức chế mạnh mẽ CH4 sản sinh. Thành phần hoạt động chính của dầu quế như cinnamaldehyde làm giảm lượng methane đến 94% ở nồng độ 5mM (Macheboeuf và cộng sự, 2008). Dầu bạc hà được biết đến có chứa methol và methyl acetate có khả năng kháng khuẩn (Mckay và Blumberg, 2006). Methanol và ethanol chiết xuất từ hạt và chồi của cây Đinh hương cũng kìm hãm sản sinh methane trong điều kiện in vitro (Patra và cộng sự, 2010). Tinh dầu Bạch đàn ức chế sản sinh CH4 đến 58% khi bổ sung 1,66ml/l (Kumar và cộng sự, 2009) và 90,3% khi bổ sung 2ml/l (Salam và cộng sự, 2009), 70% khi bổ sung 0,33g cyclodextrin, thành phần tinh dầu chiết xuất từ Bạch đàn (Tatsouka và cộng sự, 2009). Những thành phần như cineole, terpinenol, α-pinene, p-cymene, aromadendrene và phellandrene trong tinh dầu Bạch đàn cũng được chứng minh có tác dụng giảm thiểu CH4 (Bhatti và cộng sự, 2007). Một thành phần khác của dầu Bạch đàn, p-cymene làm giảm sản sinh methane đến 29% khi bổ sung ở nồng độ 2mg/l (Chaves và cộng sự, 2008), tuy nhiên α-cyclodextrin cineole lại không ảnh hưởng đến lượng methane sản sinh khi bổ sung ở nồng độ dưới 0,33g/l (Tatsouka và cộng sự, 2008). Nghiên cứu in vivo của Wang và cộng sự (2009) chỉ ra rằng, khi bổ sung tinh dầu hỗn hợp chiết xuất từ cây Kinh giới ở mức 0,25g/ngày vào khẩu phần ăn cho cừu trong 15 ngày sẽ làm giảm thấp lượng methane sinh ra.
Theo Moss và cộng sự (2000) khí methane sản sinh ra có xu hướng giảm khi bổ sung BLBĐ với mức 100 và 200g/ngày. Kết quả này phù hợp với
một loạt các nghiên cứu trước đó sử dụng Bạch đàn và các hợp chất của nó trong môi trường in vitro. Sallam và cộng sự (2010) đã báo cáo rằng lá Bạch đàn tươi rất giàu phenol tổng số và tannin tổng số nhưng chứa lượng tannin không có khả năng phân hóa (CT) không đáng kể, tuy nhiên chúng vẫn làm giảm đáng kể sự thải khí methane (53%) trong khí tích lũy sản sinh ra. Thêm vào đó, Sallam và cộng sự (2009) cho rằng nồng độ dầu Bạch đàn ở mức 25, 50, 100 và 150àl làm CH4 sản xuất ra tương ứng là 26,0; 46,8; 77,3 và 85,3%.
Ảnh hưởng ức chế sản sinh methane của tinh dầu phụ thuộc vào từng loại tinh dầu. Macheboeuf và cộng sự (2008) đã nghiên cứu chi tiết về ảnh hưởng khác nhau của tinh dầu đến hàm lượng CH4 và ABBH sản sinh. Khi bổ tinh dầu hỗn hợp chiết xuất từ cây Thì là (32% limonene) cho kết quả tỷ lệ thuận với sự giảm CH4 sản sinh. Theo Soltan và cộng sự (2009) khi bổ sung tinh dầu ở mức 16, 32, 48mg/lít nước uống cho bò sữa sẽ làm tăng trọng lượng cơ thể, giảm đơn vị thức ăn để tạo ra 1 lít sữa, và tỷ lệ này giảm 7,4; 3,8 và 4,4% so với khi không bổ sung.
Trong nghiên cứu này, để xác định mối tương quan hồi quy giữa hai phương pháp xác định lượng khí methane sinh ra chúng tôi tiến hành xây dựng phương trình hồi quy giữa hai phương pháp xác định, kết quả được thể hiện ở đồ thị 4.2.
Kết quả cho thấy có mối tương quan thuận về lượng khí methane sinh ra giữa phương pháp sử dụng hóa chất NaOH (10M) và phương pháp GC mối tương quan này khá chặt chẽ (R2 = 89,0%). Do vậy trong trường hợp không có điều kiện xác định hàm lượng khí methane sinh ra bằng máy GC, hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp dùng NaOH (10M) để thay thế và ước tính lượng khí CH4 (ml) sinh ra theo phương trình:
CH4_GC (ml) = 1,058 + 0,8453 × CH4_NaOH (ml)
ml_CH4_NaOH
ml_CH4_GC
22 20
18 16
14 12
20
18
16
14
12
10
S 0.996782
R-Sq 89.0%
R-Sq(adj) 88.1%
ml_CH4_GC = 1.058 + 0.8453 ml_CH4_NaOH
Đồ thị 4.2: Hồi quy giữa phương pháp xác định lượng khí methane sản sinh bằng phương pháp sử dụng hóa chất NaOH và phương pháp GC