3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU U
3.4. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu cụ thể
3.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1:
Thành phần hóa học của nguyên liệu thức ăn thí nghiệm
Khẩu phần cơ sở (Chất nền): được xây dựng theo tiêu chuẩn ăn cho bò cạn sữa với tỷ lệ 60% thức ăn tinh có protein thô 14% và 40% thức ăn thô (rơm) tính theo VCK (Kearl, 1982). Khẩu phần cơ sở được phối trộn tại Bộ môn Dinh dưỡng - Thức ăn chăn nuôi, Viện Chăn nuôi. Nguyên liệu dùng để xây dựng khẩu phần cơ sở là các nguồn thức ăn sẵn có (rơm khô, bột sắn, bột ngô, cám gạo, khô dầu cọ và urê) thường dùng trong các cơ sở chăn nuôi bò.
Tất cả các mẫu thức ăn và BLBĐ được phân tích các chỉ tiêu: Vật chất khô (VCK) theo TCVN 4326 – 2001, protein thô theo TCVN 4328 – 2007, chất hữu cơ (CHC) và khoáng tổng số (KTS) theo TCVN 4327 – 2007, xơ còn lại sau khi hòa tan bằng môi trường trung tính (NDF) và xơ còn lại sau khi hòa tan bằng môi trường axít (ADF) theo AOAC 973 : 18.01 tại phòng phân tích thức ăn, Viện Chăn nuôi.
3.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 2:
Ảnh hưởng của BLBĐ đến động thái sinh khí và lượng khí tích lũy tại các thời điểm theo dõi
- Chuẩn bị trước thí nghiệm
ắ Chuẩn bị 2 bũ Lai Sind 36 thỏng tuổi đó mổ lỗ dũ, khối lượng bắt đầu thí nghiệm là 215±15 (kg).
ắ Chuẩn bị khẩu phần ăn (40% rơm khụ và 60% thức ăn hỗn hợp cú 14%
protein thô), bột lá cây Bạch đàn.
ắ Mua húa chất, dụng cụ bổ sung phục vụ thớ nghiệm sinh khớ in vitro.
ắ Sấy khụ, nghiền cỏc nguyờn liệu thức ăn.
ắ Pha cỏc dung dịch.
- Tiến hành thí nghiệm sinh khí in vitro
ắ Lấy dịch dạ cỏ.
ắ Đưa mẫu và dung dịch dạ cỏ vào xylanh.
ắ Đọc và ghi chộp số liệu.
- Kết thúc thí nghiệm
ắ Xả khớ trong xylanh đem đi đo hàm lượng methane trong hổn hợp khớ thu được.
ắ Gửi cỏc mẫu phõn tớch thành phần húa học.
ắ Xử lý số liệu.
Phương pháp tiến hành thí nghiệm sinh khí in vitro
Kỹ thuật sinh khí in vitro của Menke và Steingass (1988) gồm các bước sau: chuẩn bị mẫu thức ăn ủ, xylanh và dịch dạ cỏ, dung dịch đệm và pha chế dịch ủ; tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu ủ, xylanh và dịch dạ cỏ
Theo phương pháp của Menke và Steingass (1988) với thức ăn có độ hoà tan kém, thức ăn có hàm lượng xơ cao khối lượng mẫu nên cân là 200 ± 5mg. Sau đó đặt lượng mẫu thức ăn vừa cân xuống đáy của xylanh (các xylanh đã được rửa sạch, sấy khô) không để mẫu dính vào thành xylanh vì có thể gây sai số đối với kết quả sinh khí. Mỗi mẫu thường được tiến hành với 3 xylanh. Lắp pittong đã được bôi trơn bằng vasơlin vào xylanh (vasơlin giúp cho pittong có thể trượt dễ dàng khi bị đẩy bởi áp suất do cột khí sinh ra trong quá trình ủ, mặt khác làm pittong trở lên kín khít với xylanh hơn để khí sinh ra không bị thoát ra ngoài). Không lắp pittong sát tận đáy xylanh, để một khoảng trống để theo dõi xem xylanh có bị hở không sau khi đã buộc (kẹp) đầu còn lại. Các xylanh đã chứa mẫu được đưa vào bảo quản trong tủ ấm 390C trước khi cho dung dịch ủ vào.
Dịch dạ cỏ lấy từ 2 bò cho ăn khẩu phần như nhau, nuôi cùng điều kiện
trước khi cho ăn sáng để đảm bảo thành phần và hoạt lực của vi sinh vật trong dạ cỏ tương đối ổn định. Dịch dạ cỏ lấy từ 2 bò ở cùng thời điểm khoảng 1lít rồi trộn với nhau, đựng trong một bình kín (để đảm bảo yến khí) và được giữ ấm trong bể (bồn) nước ấm 390C đến khi pha chế dung dịch ủ. Dịch dạ cỏ trước khi tiến hành đem pha chế thành dung dịch ủ phải được lọc (có thể lọc bằng vải gạc) để đảm bảo loại trừ các mảnh thức ăn lớn còn lẫn ở trong dịch dạ cỏ làm ảnh hưởng không tốt đến kết quả sinh khí trong thí nghiệm.
- Chuẩn bị dung dịch đệm và pha chế dịch ủ
Dung dịch đệm thường gồm các loại sau: dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng, dung dịch Resazurin (dung dịch có tính chất nhận biết). Các dung dịch trên có thể được pha chế trước và bảo quản đến ngay trước khi tiến hành thí nghiệm sinh khí in vitro thì pha chế thành dung dịch đệm 2 (dung dịch này chỉ được pha chế ngay trước khi tiến hành thí nghiệm, nên thường gọi là dung dịch tươi). Các dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng, dung dịch đệm 2 được pha chế theo bảng sau:
Bảng 3.1: Bảng pha chế các dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng cần thiết và dung dịch Resazurin 1. Dung dịch đệm 1 3. Dung dịch khoáng vi lượng
● 35 g NaHCO3 ● 13,2g CaCl2 .2H2O
● 4 g (NH4)HCO3 ● 10 g MnCl2 .4H2O Hoà với nước cất thành 1 lit dung dịch ● 1 g CoCl2 .6H2O 2. Dung dịch khoáng đa lượng ● 0,8 g FeCl2 .6H2O
● 5,7 g Na2HPO4 Hoà với nước cất thành 100 ml
● 6,2 g KH2PO4 4. Dung dịch Resazurin
● 0,6 g MgSO4 7H2O ● 100 mg resazurin
Hoà với nước cất thành 1 lit dung dịch Hoà với nước cất thành 100 ml
Bảng 3.2: Bảng pha chế dung dịch đệm 2 Thành
phần Lượng dung dịch cần tạo ra (ml)
500 1000 1200 1400 1500 2000
1. Nước
cất (ml) 237,5 475 570 665 712,5 950
2. DD đệm
1 (ml) 120 240 288 336 360 480
3. Đa khoáng
(ml)
120 240 288 336 360 480
4. Vi khoáng
(ml)
0,06 0,12 0,144 0,168 0,180 0,240
5.
Resazurin (ml)
0,61 1,22 1,46 1,71 1,83 2,44
Dung dịch khử 1. Nước
cất (ml) 23,8 47,5 57,1 66,6 71,3 95
2. NaOH
1N (ml) 1,0 2,0 2,4 2,8 3,0 4,0
3. Na2S.9
H2O (g) 0,168 0,336 0,360 0,470 0,504 0,672
Dung dịch đệm hai được pha xong đổ vào một bình tam giác và đặt trong một bể nước ấm 38 - 390C (trong nghiên cứu này đặt dung dịch đệm 2 trong máy khuấy từ có bể nước làm ấm) trong vòng 25 - 30 phút sau đó cho dung dịch khử vào và liên tục sục khí CO2 vào bình tam giác để tạo môi trường yếm khí cho đến khi mẫu dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt sau đó chuyển màu sáng. Bình tam giác vẫn được giữ ấm và liên tục được sục khí CO2 cho đến khi trộn lẫn dịch dạ cỏ vào.
Dung dịch ủ bao gồm dung dung dịch đệm 2 và dịch dạ cỏ đã được lọc trộn lẫn theo tỷ lệ dung dịch đệm 2/dung dịch dạ cỏ là 2/1. Sau khi đã pha chế xong dung dịch đệm 2 và chuẩn bị xong dung dịch dạ cỏ tiến hành đổ dung dịch dạ cỏ vào bình tam giác nói trên theo tỷ lệ 1/2 và vẫn tiếp tục sục khí CO2, dung dịch được tạo ra là dịch ủ. Dung dịch này được giữ ấm ở 38 - 390C và liên tục sục khí CO2 cho đến khi bơm vào các xylanh chứa mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm
Sau khi đã pha xong dung dịch ủ, chuẩn bị xong các xylanh chứa mẫu tiến hành cho dung dịch ủ vào xylanh. Lấy 30ml dung dịch ủ cho vào xylanh giữ xylanh và đẩy hết không khí ra ngoài một cách nhẹ nhàng đến khi khí thoát ra hết, buộc (kẹp) đầu kia lại và nhẹ nhàng đặt xylanh vào tủ ấm có quạt đối lưu đảm bảo nhiệt độ luôn luôn là 39 ± 0,50C. Các xylanh chứa mẫu ủ với dịch ủ và các Blank được đặt trên cùng giá nhưng các vị trí khác nhau trên giá (đầu, giữa, cuối) để đảm bảo rằng các mẫu ủ chịu ảnh hưởng khác nhau nếu có về vị trí của tủ ấm là như nhau. Sau 30 phút kể từ khi ủ lắc nhẹ xylanh và sau đó cứ một giờ lắc một lần trong suốt 10 giờ ủ đầu tiên. Ghi chép chỉ số
"ml" trên xylanh ở thời điểm 0, 3; 6; 9; 12; 24; 48; 72; 96 giờ sau khi bắt đầu ủ. Nhẹ nhàng cho thoát khí (xả khí) ra nếu pittong bị đẩy đến vạch 60ml và đưa pittong về vị trí ban đầu ở thời điểm 0 giờ. Sự giải thoát khí này nhằm giải phóng lượng khí sinh ra trong xylanh có thể tích lại gây áp lực làm ảnh hưởng không tốt đến hoạt động của vi sinh vật dạ cỏ trong dung dịch ủ. Khi
tiến hành thí nghiệm sinh khí in vitro cần thiết phải sử dụng "mẫu trắng" hay còn gọi là các Blank thường chỉ chứa 30ml dung dịch ủ trong các xylanh để tính lượng khí mà vi sinh vật sinh ra từ các chất hữu cơ còn sót lại trong dịch dạ cỏ và khí sinh ra gián tiếp từ môi trường đệm. Kết quả sinh khí từ các Blank được sử dụng để hiệu chỉnh khi tính toán kết quả sinh khí thực của các mẫu thức ăn thí nghiệm.
- Phương pháp tính toán kết quả sinh khí, động thái sinh khí in vitro
Tính toán kết quả sinh khí dựa vào lượng khí tích lũy tại các thời điểm.
Orskov và Mc Donald (1979) đưa ra phương trình mô tả khả năng phân giải thức ăn như sau:
Y = a + b(1 - e-ct) Trong đó:
Y: là thể tích khí sinh ra ở thời điểm t (ml)
a: là lượng khí sinh ra từ các chất dễ hoà tan (ml).
b: là lượng khí sinh ra từ các chất hữu cơ khó hoà tan (ml).
a+ b: là tổng lượng khí sinh ra của mẫu thức ăn đem ủ hay tiềm năng sinh khí của thức ăn đó (ml).
c: là tốc tộ sinh khí (% VCK/giờ).
t: là thời gian ủ mẫu thức ăn thí nghiệm (giờ).
Các thông số trên được tính toán dựa vào phần mềm chuyên dụng NEWAY của Chen (1997) về xử lý các kết quả phân giải chất hữu cơ và khả năng sinh khí trong các thí nghiệm in sacco và sinh khí in vitro.
Phân tích thống kê:
Số liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng SAS (SAS Inst.
Inc., Cary, NC). Số liệu được phân tích sử dụng mô hình:
Yij = à + CTi + εij
Trong đú: : Yij là biến phụ thuộc, à là trung bỡnh tổng thể, CTi là ảnh hưởng của các mức bổ sung lá Bạch đàn, εij là sai số ngẫu nhiên. So sánh đa chiều
các giá trị trung bình của các công thức bằng Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (Steel và Torrie, 1980).
3.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 3:
Ảnh hưởng của BLBĐ đến tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô (VCK) và tỷ lệ tiêu hóa chất hữu cơ (CHC)
Các chỉ tiêu nghiên cứu của nội dung 3 bao gồm:
- Tỷ lệ tiêu hóa vật chất khô và chất hữu cơ in vitro của các mức bổ sung BLBĐ khác nhau ở các thời điểm 12, 24 và 48 giờ ủ ấm.
Tiêu hóa vật chất khô và tiêu hóa chất hữu cơ in vitro sẽ được xác định ở 12, 24 và 48 giờ sau khi lên men theo phương pháp củaVan Soest và Robertson (1985). Phần dung dịch còn lại sau khi lên men được lọc sử dụng giấy lọc Whatman No 4, mẫu được đem sấy khô ở 1050C trong 24 giờ và cân khối lượng để xác đinh chỉ số tiêu hóa in vitro. Sau khi cân phần vật chất khô (là tổng của chất hữu cơ và khoáng tổng số) còn lại đem đốt ở 5500C (phần còn lại không cháy là khoáng tổng số) để xác định phần chất hữu cơ đã tiêu hóa.
3.4.2.4.Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 4
Lượng khí CH4 sản sinh được xác định theo 2 phương pháp như sau:
▪ Phương pháp Gas Chromatography (GC)
Các mẫu khí được phân tích bằng máy GC17A Detector FID theo phương pháp của Van Nevel (1970).
▪ Phương pháp xác định lượng khí CH4 sản sinh bằng dung dịch NaOH (10M)
Bước 1: Tại thời điểm ủ 48 giờ lấy xylanh trong tủ ấm 390 C ra thu khí vào xylanh 100 ml.
Bước 2: Chuyển toàn bộ lượng khí thu được vào lọ thủy tinh có dung tích 100 ml.
Bước 3: -Hút V1 ml khí từ lọ thủy tinh vào trong xylanh dung tích 100 ml - Chuẩn bị một xylanh dung tích 5 ml trong có chứa 4 ml dung dịch NaOH (10M).
Bước 4: Bơm từ từ dung dịch NaOH vào xylanh dung tích 100ml vừa hút mẫu ở bước 3 sau đó lắc đều trong vòng 5 phút, đọc thể tích V2 sau khi NaOH đã hấp thụ hoàn toàn CO2 (Demeyer và cộng sự, 1988; Fievez và cộng sự, 2005) theo phản ứng sau:
2NaOH +CO2 → Na2CO3 + H2O.
Bước 5: Tính kết quả dựa vào công thức:
%CO2 = v1 - (v2 - 4)
v1 ×100
%CH4 =100 - %CO2
3.4.2.5. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 5:
Ảnh hưởng của BLBĐ đến lượng axit béo bay hơi (ABBH) và sinh khối vi sinh vật
- Lượng axit béo bay hơi được xác định thông qua công thức ước tính của Getachew và cộng sự (2002) như sau:
Mmol ABBH = 0,0222 × GP24 – 0,00425 Trong đó:
ABBH: Axit béo bay hơi.
GP24: ml khí tích lũy ở thời điểm 24 giờ.
- Sinh khối VSV được tính bằng 19,3g nitơ trên kg chất hữu cơ tiêu hóa được theo Crerkawski (1986). Tức sinh khối VSV được tính theo công thức sau:
Sinh khối VSV (g/kgCHC tiêu hóa) = 19,3 × 6,25 × KgCHC tiêu hóa Trong đó:
VSV: Vi sinh vật CHC: Chất hữu cơ