CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp thử hoạt tính sinh học in vitro
Các dòng tế bào ung thư ở người gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7), LNCaP (ung thƣ tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thƣ máu cấp tính).
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2mM L-glutamine, 1,5g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10mM HEPES, và 1,0mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (GIBCO). Tế bào đƣợc cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay): Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá bằng phương pháp sulforhodamine B (SRB). Các tế bào ung thƣ đƣợc nuôi trong phiến vi lƣợng 96 giếng với nồng độ 3×104 tế bào/ml. Các mẫu đánh giá đƣợc hoà tan trong DMSO 10% đến nồng độ 100μg/ml. Các mẫu này đƣợc chia làm 3 lần. Nồng độ DMSO cuối cùng đƣợc điều chỉnh nhỏ hơn 0,1%. DMSO 10% đƣợc sử dụng làm đối chứng âm. Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương ở các nồng độ 100g/ml;
20g/ml; 4g/ml; 0,8g/ml. Phép thử kéo dài trong 3 ngày. Một phiến vi lƣợng để trống xem như là mẫu so sánh 0 ngày. Các phiến còn lại được ủ trong môi trường ẩm chứa 5% CO2 trong 72h. Trong khi đó phiến 0 ngày đƣợc ủ trong 1h. Sau khi ủ xong, quay cất dịch, thu đƣợc các tế bào ung thƣ. Các tế bào ung thƣ còn lại ở phiến 0 ngày đƣợc trộn với tricloroaxetic 10% (TCA) khoảng 1h ở 4oC. Còn các tế bào ung thƣ ở các phiến còn lại đƣợc trộn với tricloroaxetic 70% (TCA) khoảng 2h ở 4oC. Các tế bào ung thư sau khi xử lí với TCA được rửa nhiều lần với nước và làm khô bằng không khí. Sau đó, thêm vào mỗi phiến 50μl dung dịch SRB (0,4% trong CH3COOH) ở nhiệt độ phòng. Sau khi để yên khoảng 1h, các phiến đƣợc rửa 3-4 lần với CH3COOH 1% và làm khô bằng không khí. Quá trình nhuộm chỉ thực hiện duy nhất 1 lần bằng cách thêm vào 10 mM Tris base không đệm. Hàm lƣợng protein tổng số được đo ở bước sóng 515nm bằng máy Microplate Reader
35
(BioRad). Hoạt chất đƣợc chuẩn bị cho thí nghiệm ở các nồng độ 100g/ml;
20g/ml; 4g/ml; 0,8g/ml.
Phần trăm tế bào ung thƣ sống sót theo từng nồng độ mẫu thử đƣợc tính theo công thức: %growth = [OD (test substance) – OD(0-day control)]*100/[OD (negative control) – OD (0-day control)]. Dữ liệu sau đó đƣợc phân tích bằng bảng Excel và giá trị IC50 sẽ đƣợc xác định nhờ phần mềm Table Curve Version 4.
Phương pháp ức chế hình thành khối u trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro : Sử dụng phương pháp của Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao & CS, 2007, triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco‟s Modified Eagle Medium) Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum); Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Crystal Violet; Axit Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến 24 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Đọc kết quả trên kính hiển vi soi ngƣợc có chụp ảnh và nối với máy tính.
3.5.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm trên tế bào tủy xương hình sao kích thích bằng LPS
Nuôi cấy tế bào
Tế bào tủy xương hình sao (BMDCs) được lấy từ chuột C57BL/6 giống hoang dã (Taconic Farm, NY, USA). Cụ thể tủy xương từ xương chày và xương đùi chuột được lấy ra, rửa với DMEM, các tế bào tủy xương được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 chứa 10 % FBS bất hoạt bằng nhiệt (Gibco, NY,USA), 50mM 2-ME, 2mM glutamine với dịch nuôi tế bào lai J558L 3% có chứa yếu tố kích thích các đại thực bào – bạch cầu hạt mielin (granulocyte–macrophage colony- stimulatingfactor (GM-CSF)). Dịch môi trường chứa GM-CSF được thay đổi hàng ngày.
36 Đo nồng độ sản sinh cytokine
Tại ngày 6, các tế bào không kết dính hoặc kết dính lỏng đƣợc thu hoạch, rửa và cấy lại trong môi trường RPMI 1640 với 5% FBS. Các tế bào sao được nuôi cấy trong đĩa 48 giếng cho tới khi đạt mật độ 2x105 tế bào/ml. Sau đó các chất nghiên cứu, pha ở nồng độ 0- 50μM được cho tiếp xúc với tế bào trước khi kích thích viêm bằng yếu tố LPS (10 ng/ml) chiết từ vi khuẩn Salmonella minnesota (Alexis, NY, USA). Sau khi kích thích 16h, dịch chiết đƣợc lọc tách và đem xác định nồng độ các interleukin IL-12 p40, IL-6, và TNF-μ bằng phương pháp ELISA (BD PharMingen,CA, USA) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Các số liệu là giá trị trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn (SD) của 3 lần lặp lại của 3 thí nghiệm độc lập.
3.5.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm ức chế yếu tố NF-κB Nuôi cấy tế bào – Hóa chất
Tế bào HepG2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) có chứa 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 units/mlpenicillin,10μg/mlstreptomycin trong tủ cấy ở 370C và 5% CO2.TNF-α người được mua của hãng ATgen (Seoul, Korea). Chất ức chế NF-κB, Pyrrolidine dithiocarbamate, đƣợc mua của hãng Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào (Cytotoxicityassay)
Phương pháp thử nghiệm sự sinh trưởng của tế bào Cell Titer 96 AQUEOU Snon-radioactive cell proliferation assay (MTS;Promega,Madison, WI,USA) đƣợc dùng để khảo sát độc tính của hoạt chất lên tế bào. Tế bào đƣợc nuôi cấy ở nồng độ 1 x 104 tế bào/giếng trong đĩa giếng 96-well plate. Sau 24h tiếp xúc với hoạt chất thử ở nồng độ 10mM, số tế bào còn sống được đo theo phương pháp MTS (Promega) ở bước sóng 490nm trên máy ELISA.
Phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) RNA tổng đƣợc chiết bằng Easy-bluereagent (iN- tRON Biotechnology, Seoul, Korea). Định lượng sản phẩm PCR thực hiện bằng chương trình Quantity One Program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) trên máy RT-PCR. Toàn bộ kết quả nghiên
37
cứu đƣợc trình bày dạng giá trị trung bình ± SEM. Số liệu phân tích ANOVA và Newman- Keuls test. Giá trị p < 0,05 đƣợc coi là có ý nghĩa.