Xây dựng quy trình phân lập murrayafoline A

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU

5.1. Nghiên cứu phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp

5.1.3. Xây dựng quy trình phân lập murrayafoline A

Sơ đồ 5.1: Quy trình phân lập murrayafoline A theo phương pháp sắc ký Bột rễ G. stenocarpa sau khi sấy khô theo quy chuẩn đƣợc chiết nóng với methanol, lọc bã và loại bỏ dung môi thu đƣợc cặn MeOH.

Tiến hành chiết phân bố cặn này với dung môi n – hexan thu đƣợc dịch chiết n – hexan.

Dịch chiết n-hexan đƣợc loại bỏ dung môi và tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/EtOAc (gradient dung môi) thu đƣợc 12 phân đoạn

Bột rễ (10 kg) Cơm rƣợu trái hẹp

1: Chiết với dung môi MeOH 3 lần 2: Lọc loại bã

3: Cất loại dung môi

Cao methanol tổng ( g)

1: Hòa tan trong hệ dung môi MeOH/H2O.

2: Chiết phân bố n-hexan 3 lần.

3: Cất loại dung môi

Cắn hexan

Mu-A thô Silica gel/ n-hexan/EtOAc gradient

Kết tinh trong hệ hexan/ EtOAc (50/1)

20 g Mu-A tinh

A1 A2 A3 A4 A5

59

(A1A12). Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy Mu-A xuất hiện ở phân đoạn thứ 5 (A5).

Phân đoạn A5 đƣợc loại bỏ dung môi và hòa tan vào một lƣợng tối thiểu hệ dung môi n-hexan/EtOAc (50/1) ở 500C, sau đó làm lạnh và để yên trong 1h. Tiến hành lọc lấy chất rắn và rửa lại bằng n-hexan lạnh.

Từ 10kg nguyên liệu khô ban đầu thu đƣợc 20g Mu-A sạch, nhƣ vậy hiệu suất phân lập Mu-A của quy trình này đạt ~ 52,6 %.

5.1.3.2. Phương pháp kết hợp sử dụng cất lôi cuốn hơi nước

Chúng tôi nhận thấy, ở nhiệt độ phòng Mu-A tồn tại ở thể rắn. Tuy nhiên, nhiệt độ nóng chảy của Mu-A không cao (52-540C), trong khi đó các hợp chất khác có mặt trong rễ cây G. stenocarpa có nhiệt độ nóng chảy tương đối cao (> 1000C).

Mặt khác Mu-A là hợp chất không hòa tan trong nước, ngay cả khi chuyển sang thể lỏng. Vì vậy, chúng tôi cho rằng có thể sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước để phân lập Mu-A.

Tiến hành khảo sát quá trình cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp với bột rễ G. stenocarpa, chúng tôi nhận thấy không có sự xuất hiện của Mu-A ở hơi nước sau khi ngƣng.

Chúng tôi cho rằng, đối với rễ cây, màng tế bào đƣợc cấu tạo từ xenlulo là ligninxenlulo liên kết rất chặt chẽ với nhau. Vì vậy sẽ là rất khó khăn đối với việc phá vỡ lớp màng tế bào này để giải phóng Mu-A nếu chỉ sử dụng hơi nước thông thường. Do đó, cần phải có các biện pháp xử lý nguyên liệu ban đầu để tăng hiệu quả quá trình phân lập Mu-A nhƣ: sử dụng áp suất và nhiệt độ cao, siêu âm, xung áp, enzyme hoặc dung môi …

Trong khuôn khổ luận án này, để đơn giản hóa các nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương án dùng dung môi MeOH để phân lập ra cặn chiết chứa Mu-A, sau đó sử dụng hơi nước là một bước trong quá trình tinh chế Mu-A.

60

Sơ đồ 5.2: Quy trình phân lập murrayafoline A sử dụng cất cuốn hơi nước Các bước thực hiện:

Bột rễ G. stenocarpa sau khi sấy khô theo quy chuẩn đƣợc ngâm chiết với methanol, lọc bã và loại bỏ dung môi thu đƣợc cặn MeOH.

Tiến hành chiết phân bố cặn này với dung môi n – hexan thu đƣợc dịch chiết n – hexan.

Dịch chiết n-hexan sau khi loại bỏ dung môi được bổ sung nước và tiến hành sục hơi nước. Hơi nước sau khi ra khỏi bình chứa được ngưng tụ và dẫn qua một bình chứa hỗn hợp dung môi n-hexan/EtOAc 9:1 (HA). Kiểm tra lƣợng Mu-A còn lại trong hỗn hợp ban đầu bằng sắc ký lớp mỏng, kết quả cho thấy sau 72h, lƣợng Mu-A đã được hơi nước đưa hết sang dung dịch HA.

Bột rễ (10 kg) Cơm rƣợu trái hẹp

1: Chiết nóng với dung môi MeOH 3 lần 2: Lọc loại bã

3: Cất loại dung môi

Cao methanol tổng ( g)

1: Hòa tan trong hệ dung môi MeOH/H2O.

2: Chiết phân bố n-hexan 3 lần.

3: Cất loại dung môi

Cắn hexan

Mu-A thô

Cất cuốn hơi nước

Kết tinh trong hệ hexan/ EtOAc (50/1)

28,5 g Mu-A tinh

61

Dung dịch HA đƣợc làm khan, loại bỏ dung môi và hòa tan vào một lƣợng tối thiểu dung dịch n-hexan/EtOAc (50/1) ở 500C, sau đó làm lạnh và để yên trong 1h. Tiến hành lọc lấy chất rắn và rửa lại bằng n-hexan lạnh thu đƣợc sản phẩm có độ sạch 99% (HPLC).

Từ 10kg nguyên liệu bột rễ ban đầu đã thu đƣợc 28,5g Mu-A tinh sạch. Hiệu suất phân lập Mu-A theo phương pháp sử dụng hơi nước đạt ~75 % so với nguyên liệu ban đầu.

Hình 5.5: Murrayafoline A tinh thể

Như vậy: Sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp sử dụng sắc ký, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thời gian dài. Vì vậy, để hoàn thiện phương pháp cần có các nghiên cứu sâu hơn để đạt hiệu quả cao nhất cho quá trình phân lập murrayafoline A.

5.1.3.3. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất murrayafoline A phân lập được từ rễ cây cơm rượu trái hẹp

Hình 5.6: Đánh số thứ tự murrayafoline A

Hợp chất này có mặt nhóm NH, điều này đƣợc khẳng định bởi singlet rộng ở 8,1 ppm trên phổ 1H-NMR (phụ lục PL 1-3), không có liên hệ với C trên phổ HMQC (phụ lục PL 1-6). Các dải hấp thụ 222,4; 243,3; 290,7; 327,4; 339,7nm trong phổ UV (phụ lục PL 1-2) của hợp chất này là các dải đặc trƣng cho hệ vòng

62

carbazole. Hơn nữa, phản ứng của chất này với axit sulfuric đặc trên sắc ký lớp mỏng silicagel cho màu lam tím là đặc trƣng cho các ancaloit carbazole.

Kết hợp phổ 13C NMR (phụ lục PL 1-4), phổ DEPT và phổ HMQC chỉ ra sự có mặt của một nhóm metyl (H 2,52 s; c 21,9 ppm), một nhóm metoxy (H 3,97 s;

c 55,5 ppm), 6 nhóm metin ở trường thấp và 6 nguyên tử cacbon bậc bốn cũng ở trường thấp. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục PL 1-3) có hai tín hiệu singlet 1H ở 6,71 và 7,46 ppm. Nếu hai nhóm metin này nằm trên hai vòng cacbon của hệ vòng carbazole thì hai nhóm thế metyl và metoxy nói trên phải chia ra nằm ở 2 vòng này và trên phổ 1H-NMR phải xuất hiện hai cặp dublet. Tuy nhiên, trên phổ này không xuất hiện 2 cặp dublet, điều này gợi ý 2 nhóm thế đó phải nằm ở cùng một vòng cacbon trong hệ vòng carbazole và không nằm ở các nguyên tử cacbon liền kề.

Trị số chuyển dịch hoá học của H liên kết với N trên vòng carbazole không thế là 10,3 ppm, nhƣng ở đây là 8,1 ppm; điều này chứng tỏ có sự che chắn nghịch từ của nhóm metoxy ở vị trí 1, làm cho tín hiệu của H liên kết với N chuyển dịch về trường mạnh (chuyển dời đi 2,2 ppm). Do vậy nhóm metyl phải ở vị trí 3. Chúng tôi lưu ý rằng ở đây còn lại hệ spin gồm 4 proton thơm tuần tự ở liền kề nhau gồm H-5, H-6, H-7, H-8. Hệ này thể hiện trên phổ 1H NMR bằng các tín hiệu dublet, triplet, triplet, dublet tương ứng. Việc gán phổ tiếp dựa trên phổ COSY, HMQC, HMBC (xem các phổ ở phần phụ lục). Trong phổ HMBC, xuất hiện liên hệ giữa proton của nhóm metyl đính vào vòng thơm với C-2, C-3 và C-4 khẳng định nhóm metyl aryl gắn vào vòng thơm ở vị trí 3. Hơn nữa, trong phổ 1H-1H COSY có xuất hiện tương tác xa giữa proton của nhóm metyl aryl với H-2 và H-4 càng khẳng định thêm điều này.

Cấu trúc của murrayafolin A (1) đã đƣợc xác định từ phổ thực nghiệm kết hợp với sự so sánh dữ liệu công bố trước đây [26].

Hình 5.7: Các mối liên hệ chính trong phổ HMBC của murrayafolin A.

NH

CH3

O

CH3 1

2 3 4

9a 4a 5

6 7

8 8a 4b

H

H H

H H

H