Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Nội dung 2: Tình hình nhiễm vi - rút cúm H5N1 trên vịt chưa tiêm phòng và tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên vịt
3.5.2.3. Phương pháp xét nghiệm HI
Sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI): phát hiệu giá kháng thể kháng vi - rút cúm H5N1 trên đàn vịt chưa tiêm phòng và tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng trên vịt
(1) Quy trình xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi - rút cúm gia cầm
Mẫu máu
Tách lấy huyết thanh
Xử lý huyết thanh
(loại bỏ các yếu tố ngưng kết không đặc hiệu)
Thực hiện phản ứng HI
Đánh giá hiệu giá kháng thể
Sơ đồ 3.1: Xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi - rút cúm gia cầm (Nguồn: Cục Thú Y, năm 2005)
(2) Các bước chuẩn bị
Chuẩn bị hồng cầu gà 10 % và 0,5 %
+ Lấy khoảng 4-5 ml máu có bổ sung thêm chất kháng đông (EDTA) trên gà khỏe mạnh, trưởng thành chưa tiêm chủng vắc-xin cúm.
+ Thêm 1 lượng tương đương PBS vào máu gà vừa lấy, lắc đều nhẹ nhàng rồi đem ly tâm 1500-2000 vòng/phút, trong 10 phút.
+ Loại bỏ phần nước trong phía trên, lập lại như vậy thêm 3-5 lần nữa đến khi nước trong là được.
+ Sử dụng công thức V1C1=V2C2 để tính hồng cầu 10 % ệ V1 =
V1, C1: là thể tích và nồng độ hiện có
V2, C2 là thể tích và nồng độ cần dùng 10 % Từ hồng cầu 10 %, áp dụng để pha hồng cầu 0,5 %
Bước 1: Xử lý huyết thanh không đặc hiệu bằng dung dịch RDE
+ Hoàn nguyên RDE bằng nước muối sinh lý vô trùng (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).
+ Pha loãng mẫu huyết thanh bằng dung dịch RDE, 1 phần mẫu + 3 phần RDE (40 àl mẫu +120 àl RDE) (sau giai đoạn này mẫu huyết thanh đó pha loóng
ẳ ).
+ Ủ mẫu ở 370C qua đêm (16-20 giờ)
+ Đem đun hỗn hợp mẫu + RDE ở 560C /45 phút, để nguội + Thờm 5àl hồng cầu gà 10 %, lắc đều, ủ ở 40C /30 phỳt.
+ Lấy phần nước bên trên để xét nghiệm.
Bước 2: kiểm tra khỏng nguyờn 4 đơn vị (4HAU)/25 àl bằng phản ứng HA.
Hiệu giá của kháng nguyên 1 đơn vị (1 HAU) là 1/256.
ệ4HAU/25 àl = (1/256) x 4 = 1/64.
Phản ứng HA
Thực hiện trên mỗi hàng 4 và 12 cột của đĩa nhựa 96 giếng, mỗi hàng có 12 giếng. Cho 25 àl PBS vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Cho 25 àl khỏng nguyên chuẩn vào giếng số 1. Pha loãng bậc 2 kháng nguyên chuẩn ở giếng 1:
chuyển 25 àl (gồm PBS và khỏng nguyờn) trỡnh tự từ giếng 1 đến giếng 11, rồi bỏ 25 àl ra ngoài. Đối chứng giếng 12 (đối chứng õm): gồm PBS và huyễn dịch hồng cầu gà 0,5 %. Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy lắc để yên trong 45 phút, rồi đọc kết quả.
Sơ đồ 3.2 Cách thực hiện phản ứng HA Giếng
Dung Dịch 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ĐC Dung dịch
PBS (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên
vi - rỳt ( àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Bỏ 25 Nồng độ pha
loãng kháng nguyên
1/2 1/4 1/18 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Huyễn dịch
hồng cầu 0,5%
( àl ) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Đọc kết quả { { { { { { { { ~ ~ ~ ~
Phản ứng dương tính (+): nếu có hiện tượng ngưng kết xảy ra (hồng cầu phân tán lấm chấm ở đáy giếng). Phản ứng âm tính (-): khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra (hồng cầu lắng xuống hay đóng nút ở đáy giếng). Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá là độ pha loãng cao nhất mà ở đó còn có phản ứng ngưng kết xảy ra. Chẳng hạn như ở sơ đồ 3.2 hiệu giá ngưng kết là 1/256.
Bước 3: xét nghiệm kháng thể kháng H5 bằng phản ứnh HI
Trên hàng thứ nhất (lặp lại trên các hàng còn lại của 96 giếng, 1 đĩa 96 giếng xột nghiệm được 8 mẫu huyết thanh), cho 25 àl PBS vào tất cả cỏc giếng (từ giếng 1 đến giếng 12). Cho 25àl huyết thanh kiểm tra vào giếng số 1. Pha loóng bậc 2 huyết thanh đú. Chuyển 25 àl (gồm PBS và huyết thanh) trỡnh tự từ giếng 1 đến giếng 10, bỏ 25 àl ra ngoài. Cho khỏng nguyờn đơn vị HAU đó pha ở trờn vào cỏc giếng của mẫu kiểm tra với lượng 25 àl. Lắc nhẹ để yờn ở nhiệt độ phũng 60 phỳt.
Cho 50 àl huyễn dịch hồng cầu 0,5 % vào tất cả cỏc giếng, lắc nhẹ để yờn trong 45 phút. Sau đó đọc kết quả. Đối chứng âm: giếng số 11 gồm PBS, kháng nguyên và huyễn dịch hồng cầu 0,5 %. Giếng 12 là giếng gồm dung dịch PBS và huyễn dịch hồng cầu 0,5 %.
Phản ứng dương tính: khi hồng cầu tụ lại ở đáy giếng của đĩa phản ứng (đóng nút), giống như giếng đối chứng (giếng 12), chứng tỏ có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Phản ứng âm tính: khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra ở giếng của đĩa phản ứng (hồng cầu phân tán lấm chấm ở đáy giếng). Hiệu giá kháng thể kháng vi - rút cúm gia cầm trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Đánh giá mẫu huyết thanh đủ bảo hộ: với gia cầm được tiêm vắc – xin, mẫu có hiệu giá kháng thể HI ≥ 1/16 (4log2) là mẫu đủ bảo hộ và đàn đủ bảo hộ là đàn phải đạt ít nhất 70 % số mẫu có hiệu giá HI ≥ 1/16.
Đánh giá mẫu huyết thanh dương tính: với gia cầm không tiêm vắc – xin, gia cầm chỉ báo. Mẫu có hiệu giá kháng thể HI ≥ 1/8 (3log2) là mẫu huyết thanh dương tính với vi - rút cúm H5N1 (theo CV 431/TY-DT của cục thú y ngày 26 tháng 3 năm 2007).
Giếng
Dung Dịch 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ĐC
12 ĐC Dung dịch PBS
(àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Huyết thanh vịt
(àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Bỏ 25 25
- - Nồng độ pha
loãng huyết thanh
1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/1208 1/4096 Kháng nguyên
vi - rỳt (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Lắc nhẹ đểyên ởnhiệt độphòng 60 phút
Huyễn dịch hồng cầu 0,5%
( àl )
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 45 phút.
Đọc kết quả ~ ~ ~ ~ { { { { { { { {
Sơ đồ: 3.3. Cách thực hiện phản ứng HI