Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Nội dung 3: Xác định sự hiện diện và lưu hành của vi - rút cúm H5N1 trên đàn vịt chưa tiêm phòng và tiêm phòng vắc – xin
3.5.3.1. Mục tiêu khảo sát
- Xác định sự hiện diện vi - rút cúm H5N1 trên đàn vịt chưa tiêm phòng và đàn vịt đã tiêm phòng vắc – xin H5N1 chủng Re-1 nhằm cảnh báo nguy cơ bùng phát dịch cúm gia cầm tại khu vực khảo sát.
3.5.3.2. Phương pháp khảo sát
(1) Đối tượng khảo sát: mẫu dịch ngoáy trên đàn vịt chưa tiêm phòng và trên đàn vịt tiêm phòng vắc – xin H5N1 chủng Re-1 năm 2007, vịt chỉ báo.
(2) Bố trí mẫu khảo sát: do hạn chế về kinh phí xét nghiệm và để tăng khả năng phát hiện vi - rút vì vậy chúng tôi tiến hành xét nghiệm với số lượng mẫu như sau:
- Vịt chưa tiêm phòng: mẫu gộp dịch ngoáy được lấy một lần song song với lấy mẫu huyết thanh trên các đàn vịt trước tiêm phòng vắc-xin đợt I/2007. Mẫu dịch ngoáy được lấy như sau: mẫu dịch ngoáy từ 5 con vịt sẽ gộp thành một mẫu để xét nghiệm, vì vậy 30 con vịt lấy mẫu sẽ có 6 mẫu gộp dịch ngoáy, trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phân bổ kiểm tra mẫu gộp dịch ngoáy vịt chưa tiêm phòng
Huyện
Mẫu dịch ngoáy xét nghiệm Số đàn Số mẫu
Ba Tri 7 42
Châu Thành 8 48
Thạnh Phú 8 48
Tổng cộng 23 138
- Vịt đã tiêm phòng năm 2007: mẫu dịch ngoáy được lấy 2 lần song song
dịch ngoáy tương tự như vịt chưa tiêm phòng, phân bổ mẫu dịch ngoáy vịt đã tiêm phòng trình bày theo bảng 3.5.
Bảng 3.5. Phân bổ kiểm tra mẫu gộp dịch ngoáy vịt sau tiêm phòng năm 2007
Huyện
Mẫu dịch ngoáy xét nghiệm lần 1
Mẫu dịch ngoáy xét nghiệm lần 2
Tổng số mẫu dịch ngoáy xét nghiệm Số đàn Số mẫu Số đàn Số mẫu Đàn XN Mẫu XN
Ba Tri 30 180 15 90 45 270
Châu Thành 32 192 12 72 44 264
Thạnh Phú 31 186 13 78 44 264
Tổng cộng 93 558 40 240 133 798
- Vịt chỉ báo: vịt 2-3 tháng tuổi hoàn toàn chưa tiêm phòng vắc – xin, kiểm tra bằng phản ứng HI, mẫu huyết thanh âm tính với vi - rút cúm H5N1. Sau khi tiêm phòng vắc – xin đợt 2/2007 1 tháng chọn 10 hộ trong đó có 04 hộ chăn nuôi vịt có hình thức nuôi nhốt và 06 hộ chăn nuôi vịt có hình thức nuôi thả đồng trên huyện Ba Tri. Mỗi đàn vịt ở mỗi hộ đã tiêm phòng. Được thả vào nuôi chung 5 vịt chỉ báo được đánh dấu để theo dõi. Tiến hành theo dõi trong 4 tháng, 50 vịt chỉ báo được lấy mẫu huyết thanh song song với lấy mẫu dịch ngoáy (gộp từ 1 mẫu hầu họng và 1 mẫu từ ổ nhớp). Mẫu huyết thanh và mẫu dịch ngoáy được kiểm tra 2 lần mỗi lần, mỗi lần cách nhau 2 tháng, Mẫu huyết thanh xét nghiệm bằng phản ứng HI để phát hiện kháng thể kháng vi - rút cúm H5N1, mẫu dịch ngoáy xét nghiệm tìm vi - rút H5N1 bằng kỹ thuật realtime RT – PCR.
Mục tiêu: xác định sự lưu hành vi - rút cúm gia cầm H5N1 trong các nhóm vịt chỉ báo.
3.5.3.3. Phương pháp xét nghiệm
Sử dụng phản ứng realtime RT-PCR để xác định sự hiện diện vi - rút cúm H5N1 trong mẫu dịch ngoáy, quy trình xét nghiệm vi - rút cúm H5N1 trên mẫu dịch ngoáy theo quyết định số 134/QĐ-TY/DT của Cục Thú y, các bước xét nghiệm được trình bày ở sơ đồ 3.4.
Mẫu dịch ngoáy
Ly trích RNA (Qiagen Rneasy ® Mini Kit)
Thực hiện Realtime RT-PCR với vi - rút typ A
Sơ đồ: 3.4. xét nghiệm realtime RT-PCR phát hiện vi - rút H5N1 trên mẫu dịch ngoáy
Kết quả typ A dương tính
Kết quả typ A âm tính
Kết quả subtyp H5 dương tính
Kết quả subtyp N1 dương tính
Kết quả subtyp H5 âm tính
Kết quả subtyp N1 âm tính Thực hiện Realtime RT-PCR với vi - rút subtyp H5
Thực hiện Realtime RT-PCR với vi - rút subtyp N1
(1) Thành phần cho phản ứng realtime RT-PCR Phát hiện vi - rút cúm
typ A
Phát hiện vi - rút cúm subtyp H5
Phát hiện vi - rút cúm subtyp N1 Thành
phần
Cho 1 phản ứng
(àl)
Thành phần
Cho 1 phản ứng
(àl)
Thành phần
Cho 1 phản ứng
(àl)
Nước 7,5 Nước 7,28 Nước 8,8
5X Buffer 5 5X Buffer 5 5X Buffer 5
MgCl2 1,5 MgCl2 1,25 MgCl2 2,5
dNTPs 0,8 dNTPs 0,8 dNTPs 0,8
Primers F25 0,5 Primers H5
F1456EA 0,5 Primers N1
R-WVDL 0,5
Primers R24 0,5 Primers H5
R1685 0,5 Primers N1
R-WVDL 0,5
Rnase 0,17 Rnase 0,17 Rnase 0,32
Enzyme 1 Enzyme 1 Enzyme 1
Probe 64 0,5 Probe H5
1637 0,5 Probe 64 0,5
RNA mẫu 8 RNA mẫu 8 RNA mẫu 8
(2) Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Realtime RT-PCR - Chu kỳ nhiệt để phát hiện vi - rút typA
1. 1 chu kỳ: 500C/30”, 940C/2”
2. 40 chu kỳ: 940C/15”, 570C/30”, 720C/20”
- Chu kỳ nhiệt để phát hiện vi - rút cúm subtyp H5 1. 1 chu kỳ: 500C/30”, 940C/2”
2. 40 chu kỳ: 940C/15”, 570C/30”, 720C/20”
- Chu kỳ nhiệt để phát hiện vi - rút cúm subtyp N1 1. 1 chu kỳ: 500C/30”, 950C/15”
2. 40 chu kỳ: 940C/15”, 570C/30”, 720C/20”
(3) Đọc kết quả
Mẫu dương tính có giá trị ngưỡng của mẫu (Ct) có Ct ≤ 35 chu kỳ, mẫu âm tính không có Ct, Mẫu nghi ngờ có Ct > 35.
3.5.3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ và sự hiện diện vi - rút cúm H5N1 trên các đàn vịt chưa tiêm phòng và các đàn vịt tiêm phòng vắc – xin H5N1 chủng Re-1.
- Tỷ lệ nhiễm vi - rút cúm H5N1 theo quy mô đàn và phương thức chăn nuôi.
- Tỷ lệ nhiễm vi - rút cúm H5N1 trên mẫu huyết thanh và mẫu dịch ngoáy của đàn vịt chỉ báo.