PHYTONCID - KHÁNG SINH THẢO MỘC
3.2. PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN THỰC VẬT
3.2.2. Thử từ dịch chiết
a. Chuẩn bị mẫu dược liệu
*Dịch chiết:lấy từ dược liệu tươi hay khụ, thường dựng dược liệu tươi, ủể tủ lạnh dương vài giờ trước khi ộp ủể cõy tạo chất khỏng khuẩn.
Nhiều trường hợp chất khỏng sinh bị mất ủi khi làm khụ dược liệu. Ngược lại cũng cú trường hợp chất khỏng khuẩn ủược tạo ra trong quỏ trỡnh làm khụ.
Dịch chiết của dược liệu với các dung môi thích hợp nếu chất kháng khuẩn không tan trong nước. Cách tiến hành:
Tuỳ dược liệu, lấy toàn cõy hay cỏc bộ phận cần thử ủem nghiền trong cối sứ với một ớt nước (cú thể thờm cỏt ủể nghiền hoặc dựng mỏy xay) cho tới khi thu ủược khối nhuyễn, nhóo ủem lọc lấy nước ủể thử. Nờn dựng nước nguội ủể khụng làm hỏng các chất bị nhiệt phân huỷ. Có khi lại chiết bằng nước sinh lý 0,9% hay nước kiềm có pH = 9,0 hoặc nước acid yếu. Nếu hoạt chất không tan trong nước phải tiến hành triết bằng các dung môi thích hợp khác như ethanol, acetol, chloroform, ether.
Dịch chiết trước khi thử cấn phải ủược thanh trựng và ở mụi trường trung tính. Nếu chất kháng khuẩn dễ bị nhiệt phân huỷ thì thanh trùng bằng cách lọc qua phếu lọc hay màng lọc
b. Phương pháp tiến hành
Tuỳ yờu cầu, mục ủớch nghiờn cứu, sử dụng cỏc phương phỏp thớ nghiệm khỏc nhau, cú thể tiến hành cả ủịnh tớnh và ủịnh lượng phytoncid. Cú hai phương phỏp chủ yếu ủược ứng dụng:
*. Phương phỏp khuyếch tỏn (thạch ủĩa)
Mục ủớch: thấy rừ phạm vi tỏc dụng và ủỏnh giỏ sơ bộ về hàm lượng khỏng sinh của dược liệu ở giai ủoạn thụ. Cần phõn biệt cỏch thử giữa khỏng sinh thụ, kháng sinh bay hơi, giữa vi khuẩn hiếu, kỵ khí. Hiện tại ở các cơ sở sản xuất, mới chỉ tiến hành thử phytoncid thụ với vi khuấn hiếu khớ bằng cỏch làm khỏng sinh ủồ.
Phương pháp này thích hợp khi nghiên cứu hàng loạt, tiết kiệm thời gian và lượng chất thử không cần nhiều. Các dịch chiết bằng dung môi hữu cơ cũng thử ủược vỡ khi nhỏ lờn mặt thạch ủĩa dung mụi sẽ bốc hơi cũn lại chất thử khụ trờn mặt mụi trường. Phương phỏp này cũng dựng ủể ủịnh lượng ủược trờn cơ sở của kớch thước vũng vụ khuẩn so sỏnh với mẫu chuẩn tiến hành trong cựng ủiều kiện.
*. Phương phỏp ủặt ống trụ (vũng khõu của Heathey) Chuẩn bị dụng cụ:
Vũng khõu: dựng cỏc ống trụ bằng kim loại ủỳc sắn khụng gỉ hay thuỷ tinh ủồng ủều, chiều cao 10mm, ủường kớnh ngoài 8mm, ủường kớnh trong 6mm ủặt lờn mặt thạch ủĩa ủó cấy vi khuẩn cần thử.
- Hộp lồng: tuỳ lượng mẫu kiểm tra, ủường kớnh hộp lồng ủể chuẩn bị thạch.
Hộp lồng thường cú kớch thước ủường kớnh: 20cm, 10 cm, và 8 cm; dụng cụ cần thiết khỏc của phũng thớ nghiệm pipette, cốc ủong, ống ủong.
- Các loại vi khuẩn cần thử
- Thạch: chuẩn bị 2 loại: thạch nền và thạch tráng.
+ Thạch nền: ủặc hơn thạch trỏng, thường là thạch chế trong mụi trường canh thang có thêm muối NaCl, so với thạch tráng chất dinh dưỡng ở thạch nền ít
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Dược liệu học thú y……… ……… 65
hơn. Hấp thanh trựng, bảo quản trong tủ lạnh, khi dựng ủun núng chẩy trở lại, tuỳ kớch thước hộp lồng ủổ:
Với ủĩa ∅ = 20cm, ủổ 25-30 ml/ủĩa; ∅ = 10cm ủổ 15ml/ủĩa và ∅ = 8cm ủổ10 – 12ml/ủĩa, chờủụng, bảo quản tủ lạnh dựng dần.
+ Thạch trỏng (thạch mặt): thạch bảo ủảm ủỳng, ủủ thành phần cỏc chất dinh dưỡng ủể vi khuẩn thớ nghiệm phỏt triển như huyết thanh, glucoza, cỏc acid amin, vitamin... nếu vi khuẩn yờu cầu. Khi làm, ủun núng chảy tan hết thạch, chờ nguội 46-480C cho vi khuẩn vào, lắc ủều, chia cỏc ủĩa. Thường cứ 25ml thạch trỏng cho 0,2 ml canh trựng nuụi 24 giờ/tủấm, lỏng khắp mặt ủĩa. Như vậy trong từng ủĩa cú 2 lớp thạch:
- Thạch nền: chắc hơn, dày hơn ở phía dưới
- Thạch trỏng: mỏng hơn, lỏng hơn ủó cú vi khuẩn cần thửở phớa trờn.
Khi lớp thạch trỏng ủụng lại, tiến hành ủặt khõu: sõu khoảng 1-2 mm (tức chân khâu vừa chạm tới mặt của thạch nền). Nhỏ dung dịch (từ dược liệu) cần thử vào ống khõu, mỗi ống khõu 0,1ml dịch chiết ủặt tủ lạnh 6 – 8 giờ chờ khỏng sinh khuyếch tỏn ra lớp thạch mặt, nhưng vi khuẩn chưa mọc. Sau ủú ủặt tủấm 370C/12 Ờ 18 giờ, ựọc kết quả. đánh giá mức ựộ kháng khuẩn của dược liệu căn cứ vào ủường kớnh vũng vụ khuẩn. ðường kớnh vũng vụ khuẩn ủo qua tõm vũng khõu, tới mộp vũng vụ khuẩn. Số lượng ủĩa thạch cần chuẩn bịủược tớnh theo cụng thức:
X = AxB/C
Trong ủú X: sốủĩa thạch cần chuẩn bị; A: số lượng cõy thuốc (mẫu) cần thử. B: số vi khuẩn cần thử. C: số lượng vũng khõu ủạt trong từng ủĩa.
Cỏnh ủỏnh giỏ kết quả: Kớch thước vũng vụ khuẩn cú thể phụ thuộc vào tốc ựộ khuyếch tán của chất kháng khuẩn. đánh giá ựộ mẫn cảm của vi khuẩn với từng loại phytoncid thụng qua ủường kớnh vũng vụ khuẩn. Tuỳ kớch thước vồng vụ khuẩn chia ra cỏc mức ủộ sau:
- Vi khuẩn rất mẫn cảm, ủường kớnh vũng vụ khuẩn ≥ 30 mm. Dược liệu cú tỏc dụng rất tốt trong ủiều trị.
- Vi khuẩn mẫn cảm trung bỡnh, ủường kớnh vũng vụ khuẩn ≤15 - >30mm.
Dược liệu ủiều trị cho kết quả tốt, chưa cần phối hợp thờm vị thuốc khỏc.
- Vi khuẩn mẫn cảm yếu, ủường kớnh vũng vụ khuẩn >15mm, trong ủiều trị muốn sử dụng phải tăng liều, hay phổi hợp với cỏc dược liệu khỏc ủể tăng sự mẫn cảm của vi khuẩn.
- Vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc, xung quanh ống khâu không xuất hiện vũng vụ khuẩn. Dược liệu này khụng ủược dựng trong ủiều trị với mục ủớch kháng khuẩn.
Ưu ủiểm của phương phỏp ủơn giản, an toàn và ủảm bảo ủộ chớnh xỏc vỡ:
+ Trong lúc chuẩn bị mẫu thử còn lẫn một số vi khuẩn khác, ống khâu sẽ giữ vi khuẩn không cho khuếch tán ra ngoài.
+ Một số tanin, gôm có trong dược liệu bị giữ lại trong ống khâu, không khuếch tán vào thạch làm tủa pepton cũng như thức ăn khác của vi khuẩn.
+ Nếu ống khõu ủảm bảo tiờu chuẩn quy ủịnh, chỉ phytoncid ủược thẩm thấu vào thạch, rồi ức chế sự phát triển hay tiêu diệt vi khuẩn. Kích thước vòng vô khuẩn to, nhỏ tuỳ thuộc tác dụng dược lý mạnh hay yếu của phytoncid.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Dược liệu học thú y……… ……… 66
Nếu thử trên nấm thì hỗn dịch bào tử trước khi trộn với môi trường nên lọc qua bụng ủó khử trựng ủể loại sợi nấm. Trường hợp khụng cú bào tử thỡ sợi nấm phải ủược cấy trước trong mụi trường canh thang. Sau ủú ủem mụi trường trờn lắc kỹ với bi thuỷ tinh ủể cắt nhỏ sợi nấm trước khi trộn với thạch.
* Phương phỏp ủụclỗ thạch
Phương pháp này cũng giống phương pháp trên chỉ thay ống trụ bằng cách ủục lỗ trong lớp thạch mặt. Cú thể dựng nỳt khoan chai ủường kớnh 8mm hay dựng ngay ống trụủể tạo lỗ, dựng pink gắp thạch ra khỏi lỗ.
* Phương pháp khoanh giấy.
Cũng giống phương pháp ống trụ chỉ khác là thay ống trụ bằng khoanh giấy thấm. Cỏc khoanh giấy thấm sau khi khử trựng ủược ủặt lờn mặt thạch ủó cấy vi khuẩn. Mỗi khoang giấy nhỏ 2 hay 3 giọt dịch chiết của dược liệu cần thử lên. Cũng cú thể nhỳng ngay khoang giấy vào dung dịch dược liệu rồi ủặt lờn mặt thạch.
* Phương phỏp của giỏo sư ô ðặng Văn Ngữ ằ
Các mẫu dược liệu nghiên cứu sau khi phơi khô, nghiền bột mịn, nén thành viờn hỡnh trụ cao 8mm ủường kớnh 3mm. Thạch ủĩa gồm 2 lớp chế nhưủó giới thiệu ở trờn, ủạt viờn dược liệu vào hộp lồng ủể tủ lạnh 40C/6h chờ hoạt chất khỏng sinh trong viên thuốc khuyếch tán ra môi trường thạch trong khi vi khuẩn vẫn chưa mọc.
Qua 6 giờ, chuyển ủĩa thạch vào tủấm 370C/12 -18 giờ, ủọc kết quả bằng cỏch do vòng vô khuẩn xung quanh chân viên nén.
b. phương pháp pha loãng
Dùng môi trường lỏng. Cho vào ống nghiệm a ml dịch chiết, thêm a ml canh thang (ủồng thể tớch dung dịch mụi trường tức dịch chiết cần thử ủược pha loóng gấp ủụi). Từống thứ nhất sau khi lắc, trộn ủều lấy ra a ml chuyển sang ống thứ hai ủó cú sẵn a ml mụi trường (dịch chiết pha loóng gấp bốn). Cứ làm như thể ủến hết ụng nghiệm (thường sử dụng 10 ống). Ống cuối cựng lấy a ml sau khi ủó lắc, trộn bỏủi. Ta ủược hệ nồng ủộ pha loóng dần gồm 10 ống nghiệm. Cuối cựng thờm vào mỗi ống nghiệm một lượng vi khuẩn như nhau, ủặt tủấm 370C trong thời gian thớch hợp. Nếu ủịnh lượng cần tiến hành song song với một dóy ống khỏc nhưng ủó biết trước nồng ủộ.
ðọc kết quả bằng cỏch tỡm nồng ủộ pha loóng lớn nhất mà vi khuẩn thử khụng mọc ủược. Kiểm tra lại bằng cỏch lấy một phần dung dịch của ụng ủú chuyển vào ống nghiệm khỏc cú chứa sẵn mụi trường vụ trựng. Sau khi ủặt tủ ấm 370C trong thời gian thớch hợp, vi khuẩn vẫn mọc tức ủú là nồng ủộ kỡm khuẩn.
Ngược lại, nếu vi khuẩn không mọc tức là diệt khuẩn.
Yờu cầu chung của phương phỏp hệ nồng ủộ pha loóng:
+ Số lượng vi khuẩn trong từng nồng ủộ phải ủược xỏc ủịnh và phải giống nhau, thường là 0,1-0,2 àl/ống.
+ Vi khuẩn thí nghiệm phải nuôi trong môi trường luôn luôn có các thành phần giống nhau, nhiệt ủộ xỏc ủịnh và tuổi giống nhau.
+ Trong mụi trường loóng, muốn cú kết quả chớnh xỏc về nồng ủộ tối tiểu tỏc dụng, ta cú thể chọn 2-3 ống nghiệm liền nhau ở nồng ủộ nghỉ ngờ, cấy lờn 2-3 ủĩa thạch ủặt tủ ấm 24 giờ (mỗi ống cấy1ủĩa). Nếu vi khuẩn ởủĩa nào khụng mọc (nhưng phải liền với ống cú nồng ủộ thấp hơn vi khuẩn vẫn mọc). Ta gọi nồng ủộở ủĩa ủú là nồng ủộ tối thiểu tỏc dụng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Dược liệu học thú y……… ……… 67
c. Phương pháp thử phytoncid bay hơi
Với vi khuẩn hiếu khí. Nhiều dược liệu chứa các thành phần bay hơi có tác dụng khỏng khuẩn. ðể phỏt hiện, tiến hành như sau: nghiờn dược liệu rồi ủặt một dỳm nhỏ bột vào hộp lồng petri sau ủú ỳp nửa hộp lồng ủó cõy vi khuẩn lờn trờn.
Nếu cú khỏng sinh thỡ sẽ tạo vựng vụ khuẩn ở mặt thạch ủối diện với dược liệu Với vi khuẩn kỵ khớ. Lấy 2 nửa hộp lồng cú ủường kớnh bằng nhau. Nửa trờn hộp lồng ủổ thạch và cấy vi khuẩn cần thử. Nửa dưới hộp lồng ủặt bụng cú tẩm dịch chiết của kháng sinh hay dịch chiết từ dược liệu nghi có phytoncid bay hơi.
Gắn parafin ủặt tủẩm 370C/12 giờủọc kết quả. Nếu khỏng sinh cú khả năng ức chế vi khuẩn thí nghiệm, ở nửa trên của hộp lồng vi khuẩn không mọc, hay mọc rất ít so với ủối chứng.
d. Phương pháp kết hợp với sắc ký giấy.
Chấm dịch chiết dược liệu lên giấy sắc ký, triển khai bằng hệ dung môi thớch hợp, bốc bay dung mụi, gắn băng giấy sắc ký lờn mặt ủĩa thạch ủó cấy vi khuẩn. ðặt tủấm 370C/3 giờ, quan sát vòng vô khuẩn. Tuỳ phương pháp có thể biết rõ và sớm hơn 4-5 giờ bằng cách phun dung dịch 2,3,5-triphenyl tetrezolium cholorid (TTC) trong nước hay dung dịch 0,5% 2,6-dichlorophenolindophenol (DCP), lại ủặt tủấm thờm 30 phỳt. Với TTC sẽ cú vựng vụ khuẩn trắng trờn nền ủỏ, với DCP cú vựng xanh trờn nền trắng. Sự thay ủổi màu thuốc thử dựa vào dehydrogenase của vi khuẩn Bacillus subtilis hoặc E.coli.