1.6.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí
Vi sinh vật hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong ủiều kiện cú oxy phõn tử (TCVN 4884/2005) . Thụng qua việc xỏc ủịnh chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí trong mẫu phản ánh tình trạng vệ sinh trong quá trỡnh chế biến, ủộ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng thực phẩm. Xỏc ủịnh tổng số vi khuẩn hiếu khớ ủược xem là phương phỏp tốt nhất ủể ước lượng số vi khuẩn xõm nhập vào thực phẩm.
Hệ vi khuẩn cú mặt trong thịt ủược xỏc ủịnh thành 2 nhúm, dựa theo mức ủộ và ủiều kiện phỏt triển của chỳng gồm:
+ Nhúm vi khuẩn ưa nhiệt: Phỏt triển tốt ở nhiệt ủộ 37°C và ngừng phỏt triển ở nhiệt ủộ thấp khoảng 1°C. °C
+ Nhúm vi khuẩn ưa lạnh: Sinh trưởng và phỏt triển ở nhiệt ủộ thấp hơn.
Việc phõn nhúm này chỉ mang ý nghĩa tương ủối.
Nhúm vi khuẩn ưa lạnh cú thể phỏt triển trong phạm vi nhiệt ủộ từ 0°C – 30°C, song nhiệt ủộ tối ưu là 10°C – 15°C.
Tổng số vi khuẩn hiếu khớ trong thịt cú thể thay ủổi theo thời gian, ủiều kiện sản xuất và bảo quản. Vi khuẩn ưa nhiệt có thể xâm nhập vào thân thịt ngay sau khi giết mổ, bởi vậy cần kiểm tra nhúm vi khuẩn ưa nhiệt ở nhiệt ủộ nuụi cấy từ 35°C – 37°C.
Theo TCVN 4884:2005 nhiệt ủộ thớch hợp ủể nuụi cấy vi khuẩn hiếu khớ trong thực phẩm có thể áp dụng cho mọi vùng là 30°C.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
Sự phát hiện số lượng vi sinh vật hiếu khí quá cao trong thân thịt chứng tỏ ủiều kiện vệ sinh trong quỏ trỡnh giết mổ là khụng tốt. Chỉ tiờu này ủược coi là nhõn tố chỉ ủiểm về vệ sinh thực phẩm. Tuy nhiờn khụng thể ủỏnh giỏ rằng tổng số vi khuẩn ở mức ủộ thấp cú nghĩa là sản phẩm an toàn. Trong một số trường hợp, chỉ tiờu tổng số vi sinh vật hiếu khớ thấp nhưng chứa ủộc tố gõy ngộ ủộc của vi khuẩn, vớ dụ như ngộ ủộc Enterotoxin của S.aureus. Hay trong trường hợp thực phẩm lờn men khụng thể ủỏnh giỏ chất lượng vệ sinh theo tiờu chớ này.
1.6.2. Vi khuẩn E.coli
Vi khuẩn Escherichia coli ( E. coli ) thuộc họ Enterobacteriaceae là trực khuẩn bắt màu gram õm, hỡnh gậy ngắn 2 ủầu trũn, cú lụng, di ủộng mạnh, khụng sinh nha bào, một số cú màng nhầy và cú thể cú giỏp mụ. E.coli ủược Buchner tỡm ra vào năm 1885 và ủược Escherich nghiờn cứu ủầy ủủ năm 1886. E.coli là vi khuẩn hiếu khớ hay yếm khớ tựy tiện, cú thể sinh trưởng phỏt triển trong khoảng nhiệt ủộ 7-48°C, nhiệt ủộ thớch hợp nhất là 37°C. Chỳng cú thể phỏt triển ủược pH trong khoảng 4,4-8,0 và dải tối ưu là pH từ 7,2-7,4.
Những chủng ủiển hỡnh sinh Indol, khụng cú urease, phản ứng methyl dương tớnh, lờn men ủường glucose cú sinh hơi, lờn men ủường mannit và lactose. E. coli ủược ủặc trưng bởi enzym ò-galactase và enzym ò-Glucoronidase nờn nú cú tớnh chất lờn men sinh hơi mạnh ủường galactose và lactose.
Trong cỏc loại vi khuẩn nhúm Coliform, E.coli thường ủược dựng làm chỉ ủiểm vỡ vi khuẩn này ủặc hiệu cho sự ụ nhiễm phõn hơn Enterobacter aerogenes. ðể phỏt hiện E.coli, người ta sử dụng cụng thức IMViC trong ủú I = khả năng sinh indol, M = phản ứng ủỏ methyl, V = Voges- Proskauer (khả năng sinh aceton) và C = khả năng sử dụng citrate.
Dựa vào ủú, vi khuẩn này ủược phõn biệt với Salmonella như sau:
I M V C
E.coli + + - -
Salmonella + - + -
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
Cú 3 loại khỏng nguyờn ủược dựng ủể ủịnh nhúm khỏng nguyờn của E.coli: kháng nguyên O (kháng nguyên thân chịu nhiệt), kháng nguyên K (kháng nguyên thân không chịu nhiệt) và kháng nguyên H (kháng nguyên lông không chịu nhiệt). Trong ủú khỏng nguyờn O ủược coi là yếu tố ủộc lực của vi khuẩn.
Ở thực phẩm qua cỏc biện phỏp xử lý như ướp lạnh, cấp ủụng, chiếu xạ, E.coli bị tiờu diệt trong khi một số vi sinh vật khỏc vẫn chống chịu ủược và sống sút.
Do phân bố rộng rãi trong môi trường nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu nguồn nước hay trong quá trình chế biến. Các nghiên cứu sinh thỏi học chỉ ra rằng E.coli cú nguồn gốc từ ống tiờu húa của người và cỏc ủộng vật máu nóng, dù vậy vi khuẩn này cũng có thể sống sót và sinh trưởng nhanh trong các mụi trường thớch hợp khỏc. Do ủú, sự xuất hiện của E.coli trong thực phẩm là chỉ dấu của sự ô nhiễm phân và người tiêu dùng có thể nhiễm phải các vi khuẩn gây bệnh ủường ruột khỏc như Salmonella khi tiờu thụ cỏc thực phẩm này. E.coli là chỉ dấu cú giỏ trị nhất ủối với cỏc thực phẩm sống hoặc cỏc thực phẩm khụng cần xử lý nhiệt trước khi sử dụng.
Chủng E. coli ủược phõn loại theo tớnh chất gõy bệnh và mỗi nhúm cú cơ chế gõy bệnh khác nhau. Có 7 nhóm E. coli:
∗ Enteropathogennic E.coli (EPEC): E. coli gõy bệnh ủường ruột.
∗ Entrotoxigenic E.coli (ETEC): E. coli sinh ủộc tố ruột.
∗ Enteroinvasive E.coli (EIEC): E.coli xâm nhập tế bào ruột .
∗ Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC): E. coli gây xuất huyết
∗ Verotoxinproducing E coli (VTEC): E. coli sinh ủộc tố verotoxin
∗ Enteroadherent aggregative (EA-AggEC): E.coli tập kết ở ruột, gây bệnh chủ yếu ở trẻ em.
∗ Necrosis E.coli.
Vi khuẩn E. coli sản sinh hai loại ủộc tố là ủộc tố chịu nhiệt và ủộc tố khụng chịu nhiệt:
ðộc tố chịu nhiệt ST (Heat Stable Enterotoxin): Chịu ủược nhiệt ủộ 120°C trong vũng 1 giờ và bền vững ở nhiệt ủộ thấp (bảo quản ở 20°C) nhưng bị phỏ hủy nhanh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
chóng khi hấp cao áp. ðộc tố ST kích hoạt hệ thống men Guanylate Cyclase tăng cường hoạt ủộng của GMPc, kớch thớch bài tiết nước, ngăn cản hấp thu HCO3-, Na+.
ðộc tố khụng chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin): ðộc tố vụ hoạt ở nhiệt ủộ 60°C trong vòng 15 phút. ðộc tố LT kích hoạt hệ thống men Adenylate Cyclase tăng cường hoạt ủộng AMPc, ngăn cản hấp thu Na+, Cl- từ xoang ruột vào tế bào, bài tiết nước từ mụ bào xoang ruột gây ỉa chảy.
Ngày nay người ta cho rằng cơ chế gõy ngộ ủộc của E. coli cần hai ủiều kiện là vi khuẩn phải sống và thức ăn bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều.
Triệu chứng ngộ ủộc do E. coli là ủau bụng dữ dội, ỉa chảy, trong trường hợp nặng cú thể ỉa chảy ra mỏu, sốt và nụn mửa là dấu hiệu ủiển hỡnh. Bệnh nhõn cú thể khỏi sau 10 ngày. Tuy nhiờn một số trường hợp cú thể gõy tử vong ủặc biệt ở người già và trẻ em.
Do vậy, xỏc ủịnh tổng số E. coli là việc làm bắt buộc ủối với thực phẩm lạnh ủụng cú nguồn gốc ủộng vật và là chỉ tiờu ủể ủỏnh giỏ tỡnh trạng vệ sinh thực phẩm.
Bảng 1.3. Giới hạn cho phép trong một số loại thực phẩm thông dụng (46/2007/Qð/BYT; QCVN 8-3/2012/BYT)
Stt Sản phẩm E.coli/g (ml)
1 Thịt tươi, thịt ủụng lạnh, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến.
102 2 Sản phẩm chế biến từ thịt không qua xử lý nhiệt trước
khi sử dụng.
3 3 Cỏ và thủy sản tươi: cỏ tươi, cỏ ủụng lạnh, cỏc loại
nhuyễn thể, các sản phẩm của cá.
102 4 Sản phẩm chế biến từ cá và thủy sản không qua sử lý
nhiệt trước khi sử dụng.
3
5 Thủy sản khô sơ chế. 3
6 Trứng tươi, dịch trứng tươi hoặc ủụng lạnh. 3 7 Sản phẩm chế biến từ trứng (ủó tiệt trựng theo phương
pháp Pasteur).
0
8 Sữa khô, sữa bột. 0
9 Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur. 3 10 Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp UHT. 0 11 Sản phẩm chế biến từ sữa, không qua xử lý nhiệt trước
khi sử dụng.
0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
1.6.3. Vi khuẩn Salmonella
Là những vi khuẩn thuộc họ Enterobacteria, là trực khuẩn gram âm, hiếu khí, có khả năng di ủộng, khụng sinh bào tử, khụng sinh indole hoặc acetone, lờn men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không phân giải ure, hầu hết cỏc chủng ủều sinh H2S.
Cho ủến nay ủó xỏc ủịnh ủược 2.339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella. Cỏc serotype này ủược chia theo hệ thống của Kaffmann - White dựa trờn công thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H. Ngoài một số ủược ủặt tờn riờng như S. typhi, S. paratyphi,… hầu hết cỏc serotype khỏc ủược ký hiệu bằng công thức kháng nguyên.
Theo các tác giả trong và ngoài nước S. typhimurium và S. enteritidis là 2 typ huyết thanh chủ yếu ký sinh ở ủộng vật mỏu núng và gõy ngộ ủộc thức ăn cho người.
Salmonella dễ nuụi cấy, cú thể tồn tại ở 5-45°C, nhiệt ủộ thớch hợp là 37°C, pH từ 4,5- 9,0 tối ưu là 6,5-7,5 và ủược lõy nhiễm chủ yếu qua ủường tiờu húa. 49%
trường hợp ngộ ủộc thực phẩm thịt là do thịt bị nhiễm Salmonella.
ðộc tố của Salmonella cú 2 loại gồm nội ủộc tố và ngoại ủộc tố.
ðộc tố ủường ruột của Salmonella sản sinh ra cú 2 thành phần gồm ủộc tố thẩm xuất nhanh và ủộc tố thẩm xuất chậm.
ðộc tố thẩm xuất nhanh cú cấu trỳc và hoạt tớnh giống với ủộc tố chịu nhiệt (ST) của E. coli. ðộc tố này chịu ủược nhiệt ủộ 100°C trong 4 giờ nhưng bị phỏ hủy nhanh nếu hấp cao ỏp và bền vững ở nhiệt ủộ thấp thậm chớ là ở nhiệt ủộ - 20°C. ðộc tố chịu nhiệt thực hiện khả năng thẩm xuất nhanh sau 1 giờ và có thể kéo dài 48 giờ.
ðộc tố thẩm xuất chậm của Salmonella cú cấu trỳc và thành phần giống ủộc tố khụng chịu nhiệt (LT) của E.coli, ủộc tố này bị phỏ hủy ở nhiệt ủộ 70°C sau 30 phỳt và 56°C sau 4 giờ. ðộc tố khụng chịu nhiệt của Salmonella làm thay ủổi quỏ trỡnh trao ủổi nước và chất ủiện giải dẫn ủến quỏ trỡnh rỳt nước từ cơ thể vào ruột non, gõy tiờu chảy.
ðộc tố này thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 ủến 24 giờ và cú thể kộo dài 26 ủến 48 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Vi khuẩn Salmonella cú thể sinh trưởng ở thực phẩm nhưng khụng sinh ủộc tố, khi chỳng xõm nhập vào trong ruột hoặc trong mỏu mới sinh ủộc tố gõy viờm niờm mạc ruột non. Cỏc tế bào vi khuẩn bị chết tự phõn giải làm phúng thớch nội ủộc tố.
Sự ngộ ủộc thực phẩm do nhiễm Salmonella liờn quan ủến nhiều yếu tố khỏc nhau. Nó phụ thuộc vào từng serotyp, liều lượng vi khuẩn. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào loại thức ăn và tình trạng sức khỏe của mỗi cơ thể.
ða số cỏc trường hợp gõy ngộ ủộc thực phẩm do Salmonella thường gõy nờn viờm dạ dày, ruột với triệu chứng chủ yếu là nụn mửa, ủau bụng, ủi ngoài. ðặc biệt ngộ ủộc thức ăn do S. typhi cú thể gõy nờn sốt thương hàn trầm trọng với tỷ lệ tử vong cao.
Bởi sự nguy hiểm của Salmonella với sức khỏe con người nên các cơ quan kiểm tra vệ sinh thực phẩm thường coi Salmonella là tiờu chuẩn ủầu tiờn ủỏnh giỏ sự nhiễm khuẩn ở thực phẩm cũng như quỏ trỡnh sản xuất thực phẩm. Khụng ủược cú Salmonella trong thực phẩm và sự cú mặt của vi khuẩn này khụng ủược bỏ qua khi chúng bị phát hiện.
1.6.4. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Tụ cầu cú nhiều loại nhưng khụng phải mọi tụ cầu ủều cú khả năng gõy ngộ ủộc thức ăn. Ngộ ủộc do tụ cầu thường chỉ xuất hiện khi ăn hay uống cỏc thức ăn cú nhiễm ủộc tố ruột của tụ cầu. Chỉ cú cỏc chủng tụ cầu cú men Coagulaza mới cú khả năng sinh ra ủộc tố ruột mà ủiển hỡnh là tụ cầu vàng Staphylococcus aureus.
Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus) thuộc họ Micrococcacea.
S.aureus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu Gram (+), không sinh nha bào, không cú giỏp mụ và lụng, khụng di ủộng, cú khả năng gõy ủụng huyết tương. Trong bệnh phẩm Staphylococcus aureus thường ủứng thành ủỏm nhỏ hỡnh chựm nho.
Vi khuẩn S. aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, mọc tốt trên hầu hết các loại mụi trường nuụi cấy thụng thường, nhiệt ủộ thớch hợp cho chỳng phỏt triển là 37°C, pH = 7,0-7,5.
Một số chủng tụ cầu có thể phát triển ở 6,7°C. Nhìn chung, tụ cầu có thể phát triển ủược trong khoảng nhiệt ủộ từ 7°C tới 47,8°C và tổng hợp ủộc tố trong khoảng từ 10°C ủến 46°C tốt nhất là từ 40°C ủến 45°C.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
S.aureus cú thể mọc tốt trong mụi trường khụng cú NaCl, ủồng thời cũng cú thể mọc tốt trong cỏc mụi trường cú 7% ủến 10%, thậm chớ 20% muối.
Trong tự nhiờn tụ cầu khuẩn cú mặt ở khắp nơi, trong khụng khớ, trong ủất, trong nước. Tụ cầu khuẩn là vi khuẩn hội sinh, khoảng 50% người trưởng thành và tỷ lệ cao hơn thế ở trẻ nhỏ mang vi khuẩn này trong hốc mũi. Trên da, tụ cầu thường cú ở cỏnh tay, bàn tay và mặt với tỷ lệ từ 5% ủến 30%. Ngoài da và hốc mũi, tụ cầu cũn tỡm thấy ở mắt, lưỡi và ủường ruột. Từ những nguồn này, tụ cầu cú thể ụ nhiễm vào thực phẩm, trong ủú 2 nguồn lõy lan quan trọng nhất là hốc mũi và bàn tay của người chế biến thực phẩm.
Tới nay ủó cú 18 loại ủộc tố của tụ cầu cựng cấu trỳc gen mó hoỏ ủược phỏt hiện, phổ biến là ủộc tố A, B, C1 , C2, D và E. Chỉ cú cỏc chủng tụ cầu cú men coagulase mới cú khả năng sản sinh ủộc tố này. ðộc tố ruột Enterotoxin rất bền với nhiệt ủộ: Nhiệt ủộ Pasteur húa (72°C/15 phỳt) và nhiệt ủộ 143,3°C/9 giõy khụng ủủ sức vụ hoạt ủộc tố ruột.
Enterotoxin ủề khỏng với enzym phõn giải protein như: pepxin, papain, trypxin...
ða số các chủng S.aureus có nguồn gốc từ người có khả năng sinh Enterotoxin A. Loại Enterotoxin này cũng là căn nguyờn thường gặp trong ngộ ủộc thực phẩm do tụ cầu. Nghiờn cứu của Weineke ủó cho thấy trong 120 chủng gõy ngộ ủộc thực phẩm, cỏc loại Enterotoxin phổ biến là: A 73%, B 1,7%, C 15%, D 40%. Lý giải tỷ lệ cao của Enterotoxin A và D là do quá trình tổng hợp Enterotoxin ớt chịu ảnh hưởng của mụi trường và 2 loại ủộc tố này ủược tổng hợp sớm hơn cỏc loại ủộc tố khỏc trong chu trỡnh phỏt triển của vi khuẩn so với cỏc ủộc tố khỏc.
Ngộ ủộc thực phẩm do tụ cầu là kết quả của việc ăn, việc uống phải thực phẩm ủó cú vi khuẩn này phỏt triển và sinh ủộc tố. Loại ngộ ủộc thực phẩm này biểu hiện bằng hội chứng viờm dạ dày ruột, thường xuất hiện sau khi ăn từ 1 ủến 6 giờ, thụng thường là 4 giờ. Cỏc triệu chứng gồm cú: buồn nụn, nụn, ủau quặn bụng (thường nhẹ), ủi ngoài, vó mồ hụi, ủau ủầu, mệt mỏi, cú thể hạ thõn nhiệt. Cỏc triệu chứng thường kộo dài trong 24 ủến 48 giờ, tỷ lệ tử vong rất thấp và hầu như khụng cú. Enterotoxin A, D ủược phõn lập ủa số trong cỏc vụ ngộ ủộc, Enterotoxin B ớt phổ biến hơn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
S. aureus tồn tại rất nhiều trong tự nhiờn: ủất, nước, khụng khớ, vật dụng hàng ngày, tay, da của người... Do ủú, S. aureus rất dễ nhiễm vào thực phẩm. Chớnh vỡ vậy, ngộ ủộc thức ăn do tụ cầu là rất phổ biến. Việc xỏc ủịnh S. aureus trong thịt là cần thiết ủể ủảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiờu dựng.
1.6.5. Vi khuẩn Clostridium perfringens
Clostridium perfringens (Cl. perfringens) còn có tên khác là Clostridium welchii ủược Oen và Natan phõn lập từ năm 1982 trong tổ chức cú hơi của người chết. Vi khuẩn Cl.perfringens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridiaceae.
Cl. perfringens là trực khuẩn, hai ủầu hơi trũn. Vi khuẩn khụng cú lụng, khụng cú khả năng di ủộng, cú khả năng hỡnh thành nha bào trong mụi trường trung tớnh hoặc kiềm. Vi khuẩn bắt màu Gram (+), cú khả năng khử sulfite, yếm khớ tuyệt ủối, mọc tốt trong cỏc mụi trường yếm khớ thụng thường, nhiệt ủộ thớch hợp là 37°C. Mụi trường TSC (Tryptone Sulfite Xycloserin) là mụi trường ủặc trưng ủể xỏc ủịnh Clostridium perfringens. Trong mụi trường TSC vi khuẩn ủược ủ trong ủiều kiện kỵ khớ cho khuẩn lạc ủiển hỡnh màu ủen do cú khả năng khử sunfit thành sunfua.
Ngộ ủộc thực phẩm do Cl.perfringens là tờn gọi phổ biến của cỏc ca ngộ ủộc thực phẩm do Cl.perfringens gây nên. Viêm ruột hoại tử là một căn bệnh nguy hiểm nhưng hiếm gặp do ăn phải thực phẩm nhiễm chủng ủộc tố β của Cl.perfringens nhóm C.
Giống như phần lớn cỏc chủng Cl.perfringens, cỏc chủng gõy ngộ ủộc thực phẩm cú khả năng mọc tốt trong nhiều loại mụi trường trong ủiều kiện yếm khớ.
Nhiệt ủộ thớch hợp ủể phỏt triển của Cl.perfringens là từ 20°C ủến 25°C, tốt nhất là từ 37°C ủến 45°C. PH thớch hợp cho sự phỏt triển của Cl.perfringens từ 5,5 ủến 8,0.
Vi khuẩn này cú thể mọc ở hoạt tớnh nước từ 0,97 ủến 0,95 trong mụi trường sucrose hoặc NaCl. Cl.perfringens mọc tốt nhất ở ủiểm ủẳng ủiện (Eh)+ 320mv.
Cl.perfringens cần ít nhất 13 acid amin cho quá trình phát triển cùng với biotin, anto theate, pyridoxal… và các thành phần khác. Cl.perfringens bị ức chế ở môi trường có 5% NaCl.
Cl.perfringens phân bố rộng rãi trong môi trường, trong ruột của người và ủộng vật. Nha bào cú thể tồn tại trong bựn ủất, những vựng ụ nhiễm phõn người và