Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm hợp chất thứ cấp trong cây Diệp hạ châu
Hợp chất thứ cấp có 3 nhóm chính, bao gồm: nhóm terpenoid, nhóm phenolic, nhóm alkaloid. Trong đó, tinh dầu và saponin thuộc nhóm terpenoid có vai trò quan trọng trong việc tạo hàng rào phòng thủ của thực vật. Chưa thấy có báo cáo nào nói về tính kháng khuẩn của thực vật là từ tinh dầu, nên việc chiết tách tinh dầu không thực hiện trong đề tài này.
3.6.1 Chiết nhómt alkaloid
Theo quy trình đã đề cập ở trên, bước ban đầu phải dùng methanol hay ethanol để phá vỡ tế bào, lôi kéo được càng nhiều loại hợp chất tự nhiên ra khỏi tế bào càng tốt. Việc dùng thêm acid acetic 10% trong ethanol để chuyển hóa alkaloid thành dạng muối hòa tan, một số quy trình chiết alkaloid dùng acid mạnh như H2SO4, HCl với nồng độ pha loãng. Kế đó kiềm hóa đến pH 9-10 để phóng thích alkaloid, loại alkaloid hoàn toàn khỏi muối, cuối cùng là lựa chọn một dung môi thích hợp để chiết alkaloid, là chloroform.
Một vài công bố nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc chiết alkaloid từ bã dược liệu đôi khi có hiệu quả cao hơn khi dùng dịch chiết đầu tiên từ bột dược liệu. Theo quy trình chiết alkaloid từ bã dược liệu, đầu tiên acid hóa dung môi chiết để tăng hàm lượng phenolic và acid béo, loại bỏ các hợp chất này tốt nhất ở pH 4, bã dược liệu tiếp tục được ngâm với methanol hay ethanol để lấy các loại hợp chất tự nhiên, rồi tiếp tục quy trình với việc kiềm hóa và chiết bằng chloroform.
Định tính alkaloid từ dịch chiết
Hòa cắn alkaloid với nước acid H2SO4 2% trong ống nghiệm, nhỏ thuốc thử Mayer, Wagner vào thì có phản ứng tạo màu. Thuốc thử Wagner cho màu nâu đỏ, thuốc thử Mayer cho màu vàng.
b) a)
Ảnh 3.9: Định tính alkaloid từ dịch chiết alkaloid cây Diệp hạ châu.
a) Trước khi cho thuốc thử, b) Sau khi cho thuốc thử
3.6.2 Chiết hợp chất phenolic
Theo như kết quả của tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết [15] thì chiết hợp chất phenolic và tannin có thể dùng acetone 70% và 50%, methanol 50%, nhưng nồng độ chiết được hàm lượng phenolic và tannin nhiều nhất là acetone 70%.
Định tính hợp chất phenolic và tannin từ dịch chiết
Lấy một ít cắn hòa vào acetone 70% trong ống nghiệm, nhỏ một giọt FeCl3 vào quan sát, kết quả dịch chuyển màu xanh ve.
Ảnh 3.10: Định tính hợp chất phenolic và tannin từ dịch chiết phenolic cây Diệp hạ châu.
3.6.3 Chiết saponin
Định tính thành phần saponin trong dược liệu khô ban đầu:
Qua việc khảo sát phản ứng tạo bọt của bột Diệp hạ châu, nhận thấy Diệp hạ châu không chứa saponin nên việc tách chiết thành phần saponin không được tiến hành.
Ảnh 3.11: Định tính thành phần saponin trong Diệp hạ châu.
Tiếp tục thử tính kháng khuẩn với cắn phenolic và cắn alkaloid, cắn alkaloid có tính kháng khuẩn, cắn phenolic không có tính kháng khuẩn (không xuất hiện vòng vô khuẩn). Lý thuyết cho thấy hợp chất phenolic gồm nhiều chất có tính kháng khuẩn như tannin, coumarin, flavonoid...nhưng do bị hạn chế thời gian nên việc chiết tách và thử tính kháng khuẩn của nhóm hợp chất phenolic chưa được khảo sát.
Tiến hành xác định MIC với cắn alkaloid.
Bảng 3.5: Kết quả xác định MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu
Gram dương Gram âm
St t
Nồng độ, mg bột dược
liệu/ml SA MRSA SF E.coli PA
1 5000 + + + + +
2 2500 + + + + +
3 1250 + + + + +
4 625 + + + + +
5 312,5 + + + + +
6 156,25 + + + + +
7 78,125 + + + + -
8 39,0625 - + + + -
9 19,53125 - - - - -
10 9,765625 - - - - -
SA: Staphylococcus aureus, SF: Streptococcus faecalis, PA: Pseudomonas aeruginosa
Một số hình ảnh thực nghiệm xác định MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu
Ảnh 3.12: Xác định MIC của cắn alkaloid cây Diệp hạ châu.
a) Staphylococcus aureus, b) MRSA, c) Streptococcus faecalis, d) Pseudomonas aeruginosa, e) E.coli
Dịch chiết alkaloid Diệp hạ châu có tính kháng khuẩn rất rõ, riêng hình 3.11 c) kết quả rất mờ là do chủng Streptococcus faecalis là vi khuẩn lactic, cần rất nhiều dinh dưỡng để phát triển nhưng lại thử nghiệm trên môi trường NA nên chủng mọc yếu khó quan sát.
Như vậy, tính kháng khuẩn của Diệp hạ châu chủ yếu là tác động của nhóm alkaloid. MIC của cắn alkaloid Diệp hạ châu đối với MRSA, Streptococcus faecalis và E.coli là 39,0625 mg bột dược liệu/ml, với Staphylococcus aureus là 78,125 mg bột dược liệu/ml và với Pseudomonas aeruginosa là 156,25 mg bột dược liệu/ml.
a) b)
d) e)
c)